不同惡性程度膠質瘤中血管生成擬態的鑒定及其臨床意義*

西安交通大學醫學院第一附屬醫院(西安 710061) 郭世文 張 熙 尉春艷

目前研究發現,在一些高度惡性腫瘤中存在一種特殊的血液供應方式,它沒有血管內皮細胞參與,代之以內皮化的腫瘤細胞,這種血液供應方式被稱為血管生成擬態(Vasculogenic mimicry,VM)。目前在多種腫瘤中發現了血管生成擬態,如黑色素瘤,肝癌,卵巢癌等。膠質瘤是最常見的顱內原發性腫瘤,治療效果不佳,患者大多在術后 2年內死亡。本研究通過對Ⅱ～Ⅲ級人腦膠質瘤細胞 SHG44以及Ⅳ級人腦膠質瘤細胞U87的三維培養并利用 HE染色和免疫組織化學技術和組織化學(CD34-PAS)雙重染色技術觀察不同惡性程度人腦膠質瘤石蠟切片,確定膠質瘤中是否存在血管生成擬態及其與膠質瘤惡性程度的關系。

材料與方法

1 材 料 U87膠質瘤細胞由 ATCC(American type culture collection)提供,SHG44膠質瘤細胞由第四軍醫大學神經外科研究所提供,鼠尾膠原蛋白Ⅰ型購自生友生物技術有限公司,85例人腦膠質瘤標本為西安交通大學醫學院第一附屬醫院、第二附屬醫院2002～ 2009年手術存檔石蠟標本,術后均經病理診斷證實為膠質瘤,包括 65例星形細胞瘤,8例髓母細胞瘤,7例室管膜母細胞瘤,5例少突膠質細胞瘤。其中Ⅰ級 12例 ,Ⅱ 級 17例,Ⅲ 級 18例 ,Ⅳ級 38例。

2 方 法 ①細胞的三維培養:將 200 μ l鼠尾膠原蛋白加到置于冰浴的離心管中,加入 690 μ l無菌水,然后加到 12 μ l的 0.1mol/L NaOH中,再加入 100 μ l的 10× PBS,混勻后加入到 24孔板中,每孔加入100 μ l,室溫下放置 30min,待膠凝固后,每孔加入 U87細胞 1× 104,常規培養 48h。 將 SHG44細胞設為缺氧組及對照組,制膠方法同前,待膠凝固后,每孔加入SHG44細胞 1×104,缺氧組加入二氯化鈷(CoCl2)100 μ mol/L,常規培養 72h。 ② HE染色和免疫組織化學與組織化學雙重染色方法:免疫組織化學采用 SP法,按照 CD34免疫組化試劑盒步驟操作,顯微鏡下觀察,血管內皮呈現棕黃色后,蒸餾水沖洗 1min終止顯色反應;將切片置于 0.5%的過碘酸溶液中氧化15min;蒸餾水沖洗 2次,每次 3min,然后置于 Schiff液中,避光環境下 PAS反應 15min;蒸餾水洗 3次,每次 1min,流水沖洗 3min,蘇木靜染色 5min,流水沖洗2min,分化 ,反藍 ,常規脫水 ,透明 ,樹膠封片。

3 結果判定 腫瘤細胞彼此融合,連接成網絡結構為形成擬態血管。腫瘤組織中出現 CD34陰性,PAS染色陽性管道且管腔內發現紅細胞為擬態血管。

4 統計學方法 應用 SPSS11.5統計學軟件進行分析。用卡方檢驗,t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 膠質瘤瘤細胞株 U87及 SHG44三維培養結果 觀察 U87細胞培養 48h后可見細胞變長且相互融合,連接成網絡樣結構(圖 1)。在對照組中,SHG44培養 72h后生長紊亂,無明顯規律,但是在缺氧組中,SHG44互相連接,形成網絡樣結構。

圖1 U87細胞及 SHG44的三維培養結果 (×100)

2 CD34-PAS雙重染色 所有膠質瘤免疫組織化學染色可見血管內皮 CD34陽性,其中 14例標本可見 CD34陰性,PAS染色陽性管道,管腔內可見紅細胞(圖 2,3)。

圖2 星形細胞瘤的 HE染色

圖3 星形細胞瘤組織免疫組織化學和組織化學雙重染色(×100)

3 膠質瘤分級與血管生成擬態的關系 Ⅰ級膠質瘤中未發現血管生成擬態,Ⅱ～Ⅲ級膠質瘤中發現3例血管生成擬態陽性,陽性率為 8.6%(3/35),與Ⅰ級膠質瘤組相比,兩者具有顯著性差異(P＜0.05),Ⅳ級膠質瘤中發現 11例血管生成擬態陽性,陽性率為28.9%(11/38),與Ⅱ～Ⅲ級膠質瘤組(P＜0.05)及Ⅰ級膠質瘤組(P＜0.01)相比,均有顯著性差異。

討 論

目前的研究發現,在一些高度惡性腫瘤中,腫瘤細胞可以通過自身變形及與基質的重塑形成特殊的微循環結構,向腫瘤提供營養物質,這種微循環結構被稱為血管生成擬態[1]。血管生成擬態不依賴于血管內皮細胞,不同于傳統的腫瘤血管結構,是傳統血管生成理論的重要補充。它不但能向腫瘤提供營養物質以滿足腫瘤快速生長的需要,還能增加腫瘤與血液直接接觸的機會,使腫瘤極易侵襲及轉移[2]。血管生成擬態的形成機制還不十分清楚,目前認為與腫瘤細胞中多種蛋白異常表達相關,如缺氧誘導因子-α(HIF-1)、血管內皮生長因子(VEGF),基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)等[3]。目前已在多種腫瘤中發現了血管生成擬態現象,如黑色素瘤,卵巢癌,乳腺癌,肝癌,胃腺癌等[4～6],但是在膠質瘤中,特別是不同惡性程度的膠質瘤中是否存在血管生成擬態尚無定論。明確在膠質瘤中是否存在血管生成擬態,對于改善膠質瘤的治療效果具有重要的意義。

本研究采用三維培養技術培養Ⅱ～Ⅲ級人腦膠質瘤細胞 SHG44以及Ⅳ級人腦膠質瘤細胞 U87,發現U87在常規培養下即能相互連接,形成網狀結構,SHG44細胞在常規培養下則生長序列紊亂,無明顯規律。但是當我們使 SHG44細胞處于缺氧狀態時,SHG44細胞則呈現出明顯的規律性,也能形成網狀結構。這說明在腫瘤的生長過程中,膠質瘤中可能存在血管生成擬態現象,并且Ⅳ級人腦膠質瘤細胞更易出現擬態血管。但是,血管生成擬態并不是Ⅳ級人腦膠質瘤細胞所特有,在特定的條件下,如缺氧條件下,Ⅱ～Ⅲ級人腦膠質瘤細胞也存在血管生成擬態。膠質瘤組織的 CD34-PAS雙染結果也證實了這種觀點,在Ⅳ級人腦膠質瘤和Ⅱ～Ⅲ級人腦膠質瘤中我們均發現了血管生成擬態,Ⅳ級人腦膠質瘤血管生成擬態陽性率顯著高于Ⅱ～Ⅲ級人腦膠質瘤(P＜0.05),Ⅱ～Ⅲ級人腦膠質瘤血管生成擬態陽性率與Ⅰ級人腦膠質瘤相比,兩者也具有統計學差異(P＜0.05)。因此,血管生成擬態可能和膠質瘤的惡行程度密切相關。

分析Ⅱ～Ⅲ級人腦膠質瘤細胞在缺氧條件下形成血管生成擬態的原因,我們認為與腫瘤細胞在缺氧條件下 HIF-α蛋白、VEGF蛋白、MMP-2蛋白、MM P-9蛋白的表達上調相關。抑制腫瘤的血管生成是目前腫瘤治療的重要研究方向。目前的血管抑制治療大多以血管內皮細胞為靶點,如果僅僅針對血管內皮細胞,腫瘤組織內就會處于缺氧狀態[7],腫瘤細胞可能相互連接形成血管生成擬態,為腫瘤提供營養,導致治療失敗。如何能同時抑制血管內皮細胞依賴性血管以及擬態血管,可能會成為腫瘤血管抑制治療成功的關鍵。

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