暗紫貝母愈傷組織和不定芽誘導研究

張波 ，李軍立，李玉鋒 *，何洋， 劉震東， 謝紫瑩

（1.西華大學生物工程學院，四川 成都 610039；2.成都中醫藥大學，四川 成都610075；3.成都國嘉制藥，四川 成都610036）

暗紫貝母（F.unibracteata Hisao et K.C.Hsia）為百合科藥用植物，其干燥鱗莖，有清熱潤肺、化痰止咳的功效，主治肺熱燥咳、咯痰帶血、痰多胸悶等癥[1]。由于暗紫貝母生長環境特殊，喜寒涼氣候，野生分布于海拔3200～4500m的高山高原草地上，低于海拔3000m就不能生長，很難人工引種栽培，加之其生長周期長，產量很少.，因此價格昂貴，且過度依賴于野生資源[2-4]。暗紫貝母鱗莖離體培養，有利于野生暗紫貝母的資源保護和開辟藥材資源新途徑，實現中藥的現代化進程。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

暗紫貝母（F.unibracteata Hisao et K.C.Hsia）由四川省國嘉制藥新荷花藥材種植基地提供并鑒定。其他常見試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌材料的獲得 取暗紫貝母鮮鱗莖，先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干，然后用70%的乙醇浸泡1min，滅菌濾紙吸干，最后用0.1%的HgCl2浸泡消毒10min，無菌水沖洗5次，滅菌濾紙吸干。鱗莖切成約0.5cm的塊[1,2,5]。

1.2.2 外植體接入不同濃度配比的培養基 在無菌操作條件下，將上述塊狀鱗莖接種到pH5.8，蔗糖3%，VC0.1 g/L，附加 NAA+6-BA不同配比濃度的MS培養基上[1,6]。

1.2.3 培養方法 在0℃無菌條件下，培養48h后[4,6-8]，再在溫度：20℃，光照強度：1000-1500Lx，每天光照時間：16h的條件下進行培養[1,2]。

1.2.4 計算方法 培養50天后取材，統計接種外植體的數量，誘導出的愈傷組織數量、不定芽的數量，并計算其愈傷組織誘導率和不定芽誘導率[9-10]，最終確定誘導暗紫貝母愈傷組織和不定芽的NAA和6-BA的最佳配比濃度。

2 實驗結果與分析

2.1 培養實驗結果

鱗莖外植體接種到培養基上20d之后開始逐漸生長，一部分鱗莖體積逐漸增大，其切口處外部有透明淡黃綠色的小顆粒狀突起出現和（或）小的新芽生成，并且其誘導出的愈傷組織和不定芽體積逐漸增大，30d左右能夠清晰地看到半透明狀的質地疏松的愈傷組織和白色的不定芽，50d后愈傷組織和不定芽生長逐漸穩定（見圖1）。培養50d后，將采集到的實驗結果數據制成表1和表2。

表1 不同配比濃度NAA+6-BA誘導的鱗莖外植體愈傷組織數量

表2 不同配比濃度NAA+6-BA誘導的鱗莖外植體不定芽數量

2.2 實驗結果分析

對實驗相關結果進行計算。結果見表3、4。

表3 鱗莖外植體愈傷組織的誘導率（%）

從表3可知，不同濃度的激素組合會對鱗莖外植體愈傷組織的形成有一定影響，且其影響差異較為顯著。在NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L配比濃度的培養基上鱗莖外植體愈傷組織誘導率為53.3%，明顯高于其它濃度配比下的誘導率，比第二高誘導率高60%。

表4 鱗莖外植體不定芽的誘導率（%）

從表4可知，不同濃度的激素組合會對鱗莖新生芽的形成有一定的影響，且其影響差異較為明顯。在NAA1.2 mg/L +6-BA1.6 mg/L配比濃度的培養基上的鱗莖新芽生成率為73.3%，明顯高于其它濃度配比下的生成率，比第二高生成率高22.2%。

3 討論

文獻報道貝母鱗莖再生途徑主要有三條：1、外植體先經誘導形成愈傷組織，再由愈傷組織分化發育形成不定芽，最后由不定芽形成新的小鱗莖；2、愈傷組織表層和內層一些特化了的胚性細胞經多次分裂發育形成胚狀體，進而再由胚狀體形成小鱗莖；3、外植體表面直接生長出小芽或鱗莖，適用于暗紫貝母培育，且培育時間相對較短[3]。本實驗即采用第三條培養途徑，經實驗證明培養時間相對較短，且直接培養可避免再次培養引起的霉變。由于本實驗培養條件中光照時間為16h/d，所以誘導出的不定芽數目多于愈傷組織，且不定芽的色澤為白色，而愈傷組織呈蛋黃綠色，為質地疏松的半固態狀。

本實驗借鑒低溫誘導對組培川貝母胚狀體成苗的影響[8]和紅豆杉愈傷組織培養[6]中防褐變措施，采用外植體接種后先經低溫處理48h再進行培養的方法，此法可有效地抑制外植體內在多酚氧化酶（PPO）引起的褐變[11]。一般PPO最適溫度為20-35℃，低溫前處理可有效地抑制外植體在培育初期極易產生的褐變，同時低溫也在一定程度上抑制了霉變的發生。添加了0.1g/L的cV也能在一定程度上抑制了褐變的發生[6]，但對于暗紫貝母的適用量仍需要在今后的實驗中加以驗證和討論。PPO的最適pH值在6.0—7.4范圍，大多在7.0-7.4范圍[11]，而組織培養要求培養基的pH為5.8，因此應嚴格調試培養基的pH，也能從根本上抑制PPO的活性。

實驗表明不同濃度NAA+6-BA配比對暗紫貝母鱗莖外植體新芽的生成和愈傷組織的形成有一定的影響。在本實驗培養條件下，NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L濃度配比誘導形成的愈傷組織較多；NAA1.2mg/L +6-BA1.6mg/L濃度配比誘導生成的新芽較多；NAA1.2 mg/L +6-BA1.8 mg/L濃度配比條件下生成的新芽和愈傷組織均較多。綜合分析，NAA1.2mg/L為鱗莖誘導的適宜濃度，而愈傷組織和不定芽的誘導對6-BA濃度反應則不同，但都為適中濃度，過高或過低的濃度的NAA +6-BA組合都不適宜鱗莖的誘導。

通過對暗紫貝母愈傷組織和不定芽誘導的研究，可以進一步優化和建立川貝母培養體系，解決野生貝母資源緊缺的問題，為天然藥物的開發奠定基礎。

[1] 徐德然,高山林,蔡朝暉,等.暗紫貝母鱗莖培養中培養基的選擇和簡化實驗[J].中國藥科大學學報,1992,23(5):304-306.

[2] 李隆云,周裕書,付善全,等.康定貝母鱗莖離體繁殖研究[J].中藥材,1994,17(12):5-7.

[3] 耿茂林,馬琳,常莉,等.貝母組織培養研究進展[J].淮北煤炭師范學院學報(自然科學版),2007,28(1):38-42.

[4] 尚宏芹.植物組織培養中的三大難題概述[J].生物學教學,2010,35(6):64-66.

[5] 李玉峰,顏鈁,唐琳,等.濃蜜貝母的組織培養條件及不同時期生物堿積累的研究[J].中草藥,2003,33(5):458-459.

[6] 盛長忠,王淑芳,王寧寧,等.紅豆杉愈傷組織培養中褐變現象的初探[J].南開大學學報(自然科學版),2001,34(4):120-121.

[7] K.Y.Paek,H.N.Murthy.High frequency of bulblet regeneration from bulb scale sections of Fritillaria thunbergii[J].PlantCell,Tissue and OrganCulture ,2002,68:247-252.

[8] 李強,凌麗俐,傅華龍,等.低溫誘導對組培川貝母胚狀體成苗的影響[J].四川大學學報(自然科學版),2003,40(3):367-370.

[9] 譚豐蘋,高山林.生長調節物質對組培暗紫貝母小鱗莖生長的影響[J].植物資源與環境,1999,8(1):52-55.

[10] 高山林,朱丹妮,蔡朝暉.暗紫貝母鱗莖器官培養生長特征和生物堿累積的研究[J].中國藥科大學學報,1992,23(3):144.

[11] 張莉,陳乃富.多酚氧化酶的酶學性質及其應用研究[J].安徽農學通報,2006,12(12): 29-30.