產細菌素乳酸菌的分離與篩選

河北科技大學生物科學與工程學院 韓雪

河北省獸藥監察所 李研東

黑龍江八一農墾大學食品學院 王 穎

乳酸菌是一種在食品發酵工業和微生態制劑中廣泛應用的益生菌。它可以抑制或殺死一些病原菌和腐敗菌，有利于人和動物的健康。細菌素是乳酸菌發揮益生作用的主要物質。因其具有高效、無毒、無殘留、無抗藥性等優點，已成為抗生素有效的替代物（周志江等，2006）。本試驗旨在篩選產廣譜細菌素乳酸菌菌株，為細菌素聯合物或細菌素與其他抗菌劑聯合使用創造條件，彌補使用單一細菌素的缺陷和不足。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 乳酸菌來源 君樂寶酸奶、完達山老酸奶、槐茂醬菜、靈生阿里郎韓國泡菜（市售）；10份東北發酵酸白菜（自制）。

1.1.2 試驗菌株 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌為河北科技大學生物科學與工程學院保留菌種。

1.1.3 TGE培養基 蒸餾水 1000 mL、pH值為6.5、蛋白胨 10.00 g、酵母浸提物 4.00 g、牛肉膏6.00 g、葡萄糖10.00 g、硫酸錳0.05 g、硫酸鎂0.10 g、吐溫 80 0.2%，0.08 Mpa滅菌 30 min（韓雪和周志江，2006）。

1.2 產抑菌物質乳酸菌的分離 沾取原料液于TGE固體培養基上劃線培養，37℃靜置培養48 h。用接種環挑取單菌落接種于TGE液體培養基，37℃，培養48 h。發酵液10000 r/min離心15 min，取上清，用軟瓊脂擴散法驗證發酵上清液的抑菌效果。

平板底層平鋪薄薄一層固體TGE培養基，再將10 mL含有l06CFU大腸桿菌/枯草芽孢桿菌的軟瓊脂平鋪在固體TGE上，用打孔器在鋪好培養基的平板上打直徑為5 mm的孔，取發酵上清100 μL加入到孔中，37℃靜置培養24 h后，檢查平板上形成的抑菌圈。

1.3 產抑菌物質乳酸菌的鑒定 挑選形成抑菌圈的菌株做革蘭氏染色，觀察菌體形態和染色特征，進行過氧化氫酶試驗、耐熱試驗。厭氧或兼性厭氧的G+無芽孢菌，過氧化氫酶陰性，初步認定為乳酸菌。

1.4 抑菌物質為乳酸菌細菌素的初步確定

1.4.1 酸抑菌作用排除 為了排除乳酸菌代謝產物中有機酸對抑菌效果的影響，將5株乳酸菌發酵液上清液的pH調至中性后再進行抑菌試驗。乳酸菌發酵液10000 r/min離心15 min，取上清液，測其pH值，用l mol/L NaOH和l mol/L HCl將上清液調至pH值6.0，以大腸桿菌為指示菌，pH 6.0的乳酸溶液為對照，用軟瓊脂擴散法驗證中性上清液的抑菌效果。

1.4.2 過氧化氫抑菌作用排除 為排除過氧化氫對抑菌物質抑菌作用的影響，將5株乳酸菌發酵上清液用過氧化氫酶處理，未經處理的發酵上清為對照，大腸桿菌為指示菌，用軟瓊脂擴散法驗證上清液的抑菌效果。

1.5 細菌素性質初步確定 采用軟瓊脂擴散法檢測酶、溫度、有機溶劑對細菌素抗菌活性的影響。為檢測不同酶對細菌素抗菌活性的影響，將發酵上清液調到pH 7.0，加胰蛋白酶、蛋白酶K、α-胰凝乳酶、胃蛋白酶、DNA酶、脂肪酶和過氧化氫酶至終濃度0.5 mg/mL，37℃作用1 h，然后測定抑菌活性。

將發酵上清液分別置 60、80、100、121 ℃處理15 min，檢測細菌素對熱的耐受力。

將發酵上清液按1∶2的比例分別加入甲醛、乙醇、丙酮，室溫下處理2 h后，對混合液進行真空蒸餾處理以除掉有機溶劑。檢測細菌素對有機溶劑的耐受力。

2 結果與分析

2.1 產細菌素乳酸菌的分離 對4份市售乳酸菌來源材料和10份自制酸白菜樣品進行了試驗，每個樣品劃線培養至長出明顯的單菌落，挑選5個單菌落進行液體培養后取上清液做抑菌試驗。本試驗分別從槐茂醬菜（L1）、靈生韓國泡菜（L2）、完達山老酸奶（L3）中各分離出一株、從東北酸白菜中分離出兩株（L4、L5）具有抑菌活性（同時抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌）的菌株。

2.2 產細菌素乳酸菌的鑒定 對分離出有抑菌活性的菌株做形態學和生化試驗。5個菌株的菌落形態均為圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑、乳白色、不透明的光滑型菌落，革蘭氏染色陽性菌，不運動、無芽孢。生化試驗結果顯示，5個菌株均為厭氧或兼性厭氧，過氧化氫酶陰性。初步確定該5株菌為乳酸菌。

2.3 細菌素抑菌干擾因素排除

2.3.1 排除有機酸的影響 將發酵上清液pH調至6.0后，與對照組比，對照pH 6.0對指示菌已經沒有作用，而pH 6.0的發酵上清液對指示菌仍有抑制作用，可見排除pH干擾后，發酵液中還存在其他抑菌活性物質。

2.3.2 排除過氧化氫的影響 L1～L5菌株的濃縮上清液經過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑和濃縮上清原液的抑菌圈直徑相比變化不大（見表1），從而可以證明菌株和發酵液中的抑菌物質不完全是過氧化氫，還有另外的抑菌物質對指示菌有抑制作用。

表1 排除過氧化氫影響抑菌結果 mm

2.4 抑菌物質性質初步確定 試驗結果顯示：加蛋白酶K和胰蛋白酶后抑菌物質的活性消失，而加入過氧化氫酶、脂肪酶和DNA酶不能使其失活（見表 2）。 將提取物溶液分別置 60、80、100、121℃處理15 min后，抑菌物質仍保持活性（見表3）。有機溶劑甲醛、乙醇、丙酮均不影響抑菌物質的抑菌活性（見表4）。

表2 抑菌物質對酶的敏感性

表3 抑菌物質對溫度的敏感性

表4 抑菌物質對有機溶劑的敏感性

3 結論

乳酸菌種類繁多，被廣泛應用于乳制品、發酵植物食品如泡菜、酸菜和青貯飼料等。其產生的乳酸菌素亦被廣泛用于食品、飼料的保鮮防腐等方面（Fernandez等，2004）。本試驗通過對不同來源材料中乳酸菌的分離鑒定，初步篩選出五株對大腸桿菌（G-）和枯草芽孢桿菌（G+）均具有較強抑制作用的菌株。該5株乳酸菌代謝產生的乳酸菌素對非蛋白酶類、溫度和有機溶劑均不敏感，表現出了良好的理化性質。本試驗將進一步研究5株乳酸菌的生物學特性、安全性、抑菌范圍、抑菌物質產量，為其在食品保鮮防腐方面的應用提供依據。

[1]韓雪，周志江.乳酸片球菌細菌素的活性及特性的研究[J].食品研究與開發，2006，27（4）：19 ～21.

[2]周志江，韓燁，韓雪，等.從酸白菜中分離出一株產細菌素的乳酸片球菌[J].食品科學，2006，27（4）：89 ～92.

[3]Fernandez A，Horn N，Gasson M J，et al.Rodriguez J M.High-level coproduction of the bacteriocins nisin A and lactococcin A by Lactococcus lactis[J].Journal of Dairy Research，2004，71：216 ～221.