凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜法同時測定飼料中4種抗氧化劑

四川省農業科學院分析測試中心 楊曉鳳

抗氧化劑是確保飼料衛生安全的有效途徑之一，可作為飼料抗氧化劑的物質很多，如乙氧基喹（EQ）、叔丁基羥基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）和叔丁基對苯二酚（TBHQ）等。1998年11月召開的全國飼料添加劑標委會上規定：配合飼料中使用抗氧化劑的最高濃度是150 mg/kg（指批準使用的各種抗氧化劑的濃度總和），超量添加抗氧化劑受到限制（李侯根，2000）。因此，有必要建立一種快速、準確、可靠的檢測方法。

近年來，對抗氧化劑的檢測方法主要有氣相色譜法（穆同娜等，2007；李興根和韓芷玲，2006）、液相色譜法（胡小鐘等，2000）和氣相色譜-質譜法（郭嵐等，2007；岳振峰等，2004），但同時測定BHA、BHT、TBHQ和EQ 4種抗氧化劑的報道較少。本研究旨在建立用氣相色譜法同時測定飼料中4種抗氧化劑的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 美國Agilent 7890A氣相色譜儀，配有自動進樣器、FID檢測器；美國J2 Scientific凝膠滲透色譜儀，配有Biobeads S-X3玻璃柱（型號：CO785，22 g，19 cm×2 cm）； 瑞士 Büchi旋轉蒸發儀。

丙酮（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（分析純）、環己烷（分析純）。

標準品：BHA、BHT、TBHQ和EQ均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

標準溶液配制：（1）BHA、BHT、TBHQ： 準確稱取各標準品50 mg，分別置于50 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，此儲備液濃度為1.0 mg/mL。臨用時，根據需要，用丙酮稀釋成不同濃度的標準使用液。（2）EQ：準確稱取250 mg，置于50 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，此儲備液濃度為5.0 mg/mL。臨用時，根據需要，用丙酮稀釋成不同濃度的標準使用液。

1.2 色譜分析條件 色譜柱為Rxi-17石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氮氣（純度 ≥ 99.999%）；進樣方式：分流進樣（分流比=10∶1）；恒流模式：氮氣流速為 2.0 mL/min；氫氣流速：30 mL/min，空氣流速：400 mL/min；進樣口溫度：230℃，檢測器溫度：300℃，柱溫采用程序升溫：始溫100℃，以15℃/min升到240℃，保持2 min。在此條件下的標準色譜圖（標樣濃度為100 mg/L）及加標回收樣品色譜圖（添加水平為100 mg/kg）見圖 1。

1.3 樣品檢測步驟

1.3.1 溶劑篩選及提取方法 選擇乙睛、甲醇、正己烷、丙酮、二氯甲烷5種提取劑，比較提法，效果及回收率。提取方法為：稱取2 g（精確至0.001 g）飼料于50 mL離心管中，加人15 mL提取劑，用高速均質器以10000 r/min提取2 min，再以4000 r/min離心3 min，傾出上清液于100 mL雞心瓶中，重復提取一次，合并提取液，于45℃旋轉蒸發至近干，用10.0 mL乙酸乙酯+環己烷（1+1）溶解殘渣，過0.45 μm濾膜，供凝膠凈化。

1.3.2 GPC凈化 試驗選擇了500 mg/L的混合標樣直接過凝膠滲透色譜柱（Biobeads S-X3），采用體積比為1:1的乙酸乙酯-環己烷作為流動相，進樣量為5 mL，流速為4.7 mL/min，從8 min起每1 min收集一份樣品，共收集8份樣品溶液，分別用氣相色譜檢測各段流出液中BHA、BHT、TBHQ和EQ的含量。收集9～13 min流出的組分于旋蒸瓶中，45℃旋轉蒸發至近干，用丙酮定容至5.0 mL，溶液過0.45 μm濾膜，供氣相色譜測定。

1.3.3 4種抗氧化劑的線性關系與檢出限 用氣相色譜（GC）分析法檢測四種抗氧劑在不同濃度下（10、20、50、100、200、300、400 mg/L）的濃度 C與峰面積A進行相關性分析，同時確定各氧化劑的檢出限。

1.3.4 準確度與精密度評價,在魚粉樣品中分別添加一定量的混合抗氧化劑標準溶液，使添加濃度分別為50、100、200 mg/kg，按上述所選擇的最優條件進行測定，每個濃度重復實驗5次，得出4種抗氧化劑的回收率及相對標準偏差（RSD），

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇 5種提取溶劑提取結果如下：其中，二氯甲烷提取的雜質較多，顏色最深，且由于二氯甲烷的密度較大，樣品離心時難以分層；甲醇提取的顏色次之，不利于凈化；正己烷提取的回收率不能滿足要求；而乙腈和丙酮的回收率都能滿足要求，但丙酮提取液的顏色較乙腈提取液的顏色深，故也不被采用；乙腈極性大，穿透力強，且乙腈作為提取溶劑時很多親脂性化合物如脂肪等較少地被萃取出來，更便于凈化，因此，本實驗采用乙腈作為提取劑。

2.2 凝膠滲透色譜凈化結果 實驗結果發現：第9分鐘的流出液中開始檢出BHT、BHA、TBHQ，第10分鐘開始檢出EQ，第11 min 4種抗氧化劑均被檢出，第12分鐘未檢出BHT、BHA、TBHQ，只檢出EQ，第13分鐘也只檢出微量 EQ；第14分鐘未檢出抗氧化劑。因此，選擇留出時間為9～13 min作為4種抗氧化劑的收集時間（即收集第42～66 mL的流出液）。同時，對于飼料樣品而言，油脂和絕大部分色素在9 min前被去除掉，說明本凈化方法達到了將目標化合物和干擾雜質分離的效果。

2.3 方法的線性關系和檢出限 表1是4種抗氧化劑在不同濃度（10、20、50、100、200、300、400 mg/L）水平下進行色譜分析得到的濃度（C）與峰面積（A）的線性回歸方程及相關系數。從表1可以看出，在所測定的范圍內，4種抗氧化劑峰面積與濃度呈良好的線性關系，能準確定量。

表1 4種抗氧化劑的保留時間、線性方程和檢出限

2.4 方法的準確度與精密度 結果見表2。從表2可以看出，BHT、BHA、EQ在三種不同濃度時的回收率均大于95%（除BHA 50 mg/kg為94.7%以外），TBHQ均大于80%且4種抗氧化RSD值均小于5%。因此該法具有較好的準確性和精密度，適合飼料樣品中抗氧化劑的測定。

表2 方法的回收率及精密度 %

3 結論

GPC-GC能夠去除樣品中脂肪和色素等大分子雜質，操作簡單，重現性好，自動化程度高，能夠滿足大量樣品的快速檢測要求，可很好地用于飼料中抗氧化劑的測定。

[1]郭嵐，謝明勇，鄢愛平，等.氣相色譜-質譜法同時測定食用植物油中三種抗氧化劑[J].分析科學學報，2007，23（2）：169 ～172.

[2]胡小鐘，余建新，錢浩明，等.油脂中九種抗氧化劑的反相高效液相色譜法分離和測定[J].分析科學學報，2000，16（1）：23 ～26.

[3]李興根，韓芷玲.毛細管氣相色譜法測定食品中的酚類抗氧化劑[J].糧油食品科技，2006，14（2）：55 ～56.

[4]李侯根.飼料抗氧化劑的現狀和發展動態 [J].精細與專用化學品，2000，8：3 ～5.

[5]穆同娜，許華，李偉.凝膠滲透色譜-氣相色譜法測定食用油脂中抗氧化劑 BHA、BHT[J].食品工業科技，2007，28（1）：228 ～230.

[6]岳振峰，藍芳，謝麗琪.氣相色譜-質譜法測定XO醬中BHA、BHT和TBHQ[J].中國糧油學報，2004，19（5）:83 ～85.