纖維素降解菌的篩選及酶活力測定

摘要：從延安市寶塔區楊家灣長期堆積牛糞和秸稈的腐殖土中篩選到１７株纖維素降解菌，經剛果紅培養基、赫奇遜培養基復篩，得到ＴＣ－２、ＴＣ－４、ＴＣ－５、ＴＣ－６、ＴＣ－８、ＴＣ－１１、ＴＣ－１２、ＴＣ－１３共８株可分解纖維素的菌株，對其進行纖維素酶活力（CMCA）和濾紙酶活力（FPA）的測定。結果表明，菌株ＴＣ－１１產生的兩種酶的酶活力均較高，可作為進一步研究的試驗菌株。

關鍵詞：纖維素；降解菌；纖維素酶活力；濾紙酶活力

中圖分類號：Ｑ９３－３３１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3072-02

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｅｍｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

ＧＡＯ Ｘｉａｏ－ｐｅｎｇ，ＹＡＮＧ Ｈａｎ，ＹＵＡＮ Ｍａｏ－ｌｉｎ，ＨＥ Ｘｉａｏ－ｌｏｎｇ，ＲＥＮ Ｇｕｉ－ｍｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎ’ａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎ’ａｎ ７１６０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｄｅｇｒａｄｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓｔａｃｋｅｄ ｃｏｗ ｄｕｎｇ ａｎｄ ｓｔｒａｗ ｆｏｒ ａ ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ， ａｎｄ ｅｉｇｈｔ ｓｔｒａｉｎｓ （ＴＣ－２， ＴＣ－４， ＴＣ－５， ＴＣ－６， ＴＣ－８， ＴＣ－１１， ＴＣ－１２， ＴＣ－１３） ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ by Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ＨａｏＱｉＸｕｎ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒｌｙａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒｌｙａｓｅ ｏｆ ＴＣ－１１ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １．０ ＩＵ indicating ｔｈａｔ ＴＣ－１１ ｗａｓ ａ ｖａｌｕａｂｌｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ worth ｔｏ ｂｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ； ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ sｔｒａｉｎ； ＣＭＣＡ； ＦＰＡ

進入２１世紀以來，能源危機問題日趨嚴重。而大量的植物秸稈的主要成分——纖維素經過處理后可通過微生物發酵生產燃料、飼料、肥料等，取代目前由化工燃料合成生產的部分有機產品［１－３］。

纖維素的微生物降解已經取得了一定的成果［４－８］，但由于目前篩選得到的大多數纖維素降解菌產生的纖維素酶活力（CMCA）低下，成為制約該技術推廣應用的重要原因之一。因此，篩選產生高活性纖維素酶的菌株有著重要的意義。本研究從陜北地區堆積秸稈和牛糞的土壤中篩選出可高效降解纖維素的菌株，對其進行酶活力測定，以期為解決秸稈轉化醇類及菌肥的制造奠定科學基礎。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１供試土樣采自延安市寶塔區楊家灣長期堆積牛糞和秸稈的腐殖土。

１．１．２藥品羧甲基纖維素鈉（ＣＭＣ－Ｎａ）、溴百里藍、剛果紅、3，5-二硝基水楊酸（ＤＮＳ）試劑，均為分析純。

１．１．３儀器隔水式電熱恒溫培養箱（ＰＹＸ－ＤＨＳ－４０*５０－ＢＳ，上海躍進醫療器械廠）、紫外分光光度計（ＵＶ－１２４０，日本島津）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（ＬＳ－Ｂ５０Ｌ，江陰濱江醫療儀器廠）、氣浴式振蕩器（ＺＪＳ－１３２０，科大創新股份有限公司中佳分公司）。

１．１．４培養基ＰＤＡ培養基、ＬＢ培養基、ＣＭＣ培養基［９］、剛果紅培養基［１０］、赫奇遜培養基［１１］、產酶培養基［９］。

１．２方法

１．２．１纖維素降解菌的篩選①富集：將土樣加到ＰＤＡ液體培養基中，３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ，培養３ ｄ后取培養液以體積為５％的接種量接入ＰＤＡ液體培養基中，重復３次。②初篩：取０．５ ｍＬ富集液加入到ＣＭＣ培養基中，３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ，培養３ ｄ后劃線分離，將得到的菌株轉接在ＬＢ斜面上，４ ℃冰箱中保存備用。③復篩：將初篩的菌株接種到ＣＭＣ培養基上，選出長勢較好的菌株接種于剛果紅培養基上，選擇透明圈大且清晰的菌株，接入經處理過的濾紙條［１２］的赫奇遜液體培養基中，２８ ℃、培養４ ｄ后，根據濾紙的裂解程度，選出引起濾紙裂解效果較好的菌株作為下一步的試驗菌株。

１．２．２酶活力的測定①粗酶液的制備。取試驗菌株培養液，以體積為５％的接種量接種于產酶培養基中，３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ、培養一定時間后，取適量培養液，４ ℃、５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，上清即為粗酶液。②酶活力定義及測定方法［１２］。酶活力定義：在ｐＨ值５．０、５０ ℃條件下，１ ｍＬ粗酶液在１ ｍｉｎ內水解ＣＭＣ－Ｎａ生成１．０ μｇ的葡萄糖，稱為１個纖維素酶酶活力單位（μｇ／ｍｉｎ，ＩＵ）；相同條件下，１ ｍＬ粗酶液在１ ｍｉｎ內水解濾紙（經過去淀粉處理）生成1 μｇ葡萄糖，稱為１個濾紙酶酶活力（ＦＰＡ）單位

（μｇ／ｍｉｎ，ＩＵ）。酶活力的測定：用ＣＭＣ－Ｎａ作底物，５０ ℃恒溫水浴，粗酶液水解３０ ｍｉｎ，用ＤＮＳ法測定還原糖含量［１３］，利用還原糖的量來計算酶的活力。

２結果與分析

２．１纖維素降解菌的篩選

經過連續３次的富集、分離純化，共得到１７株菌株；經剛果紅培養基和赫奇遜培養基復篩后，選擇在剛果紅培養基上出現的透明圈大且清晰，在赫奇遜液體培養基中濾紙的裂解效果較好的８株產酶試驗菌株，分別為：ＴＣ－２、ＴＣ－４、ＴＣ－５、ＴＣ－６、ＴＣ－８、ＴＣ－１１、ＴＣ－１２、ＴＣ－１３。

２．２酶活力測定結果

２．２．１ 纖維素酶酶活力由圖１可知，在所有試驗菌株中，ＴＣ－１１的ＣＭＣ酶活力最大，１２ ｈ時酶活力即達到所有菌株酶活力的最大值（０．９９ ＩＵ）；菌株ＴＣ－１３到２４ ｈ時酶活力達０．７８ ＩＵ；而菌株ＴＣ－２、ＴＣ－５、ＴＣ－８的酶活力變化不大，同時這３株菌株的酶活力均低于０．１９ ＩＵ；其余３株菌株的酶活力隨培養時間的延長而緩慢增加。

２．２．２濾紙酶活力由圖２可知，除菌株ＴＣ－２、ＴＣ－５、ＴＣ－８外，其余５株菌株的濾紙酶活力均呈現隨培養時間的延長而增加的趨勢，到６０ ｈ時ＴＣ－１１的酶活力最大，為１．０５ ＩＵ；ＴＣ－６、ＴＣ－１２和ＴＣ－１３的酶活力也較高，為０．57～０．７1 ＩＵ。

綜合以上結果，菌株ＴＣ－１１產生的纖維素酶和濾紙酶都有較高的酶活力，因此，選擇該菌株作為下一步制作菌肥、分解纖維素產醇等研究的試驗菌株。

３討論

１）在用剛果紅培養基和赫奇遜培養基進行復

篩時，由于細胞沒有裂解，胞內酶難以釋放至細胞外，因此可能會把在胞內產纖維素酶的菌株淘汰掉，利用離心法得到的粗酶液也基本上為胞外酶。因此，本試驗測定的酶活力主要為胞外酶的活性。

２）纖維素降解菌大多來自地表覆土，為好氧菌，本試驗采用的是靜置培養分解濾紙，試驗得到的濾紙酶活力較低的菌株可能是由于缺氧，生長不佳所致，改變溶氧可能會使這些菌株的濾紙酶活力增強。

３）本試驗僅是在固定條件下，對試驗菌株產酶的情況進行了研究，而酶的產生和酶活力受諸多因素的影響。因此，得到的試驗菌株的產酶條件還有待于進一步優化。

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