2個抗白粉病小偃麥異附加系的GISH鑒定

張曉軍，暢志堅，閻曉濤，詹海仙，李 欣

（山西省農業科學院作物科學研究所，山西太原030031）

小麥白粉病（Blumeria graminis f.sp.tritici）是影響小麥高產穩產的主要病害之一，近年來有愈來愈流行的趨勢，培育和推廣抗病品種是控制該病害流行的有效措施。小麥的野生近緣種屬植物中蘊藏著許多對小麥品種改良非常重要的基因，通過遠緣雜交等方法選育附加系是利用近緣種屬有益基因的重要途徑[1-2]。

中間偃麥草對小麥白粉病免疫[3]，具有多種抗病、抗逆性狀，易與小麥雜交，且其優良基因易于在小麥背景中表達，是小麥改良育種中重要的基因源。國內外許多學者已將偃麥草的許多有益基因轉移到小麥中[4-5]。

本研究以來源于中間偃麥草的八倍體小偃麥TAI7047為供體，以高感白粉病的優質小麥品種晉太170為受體，通過回交轉育的方法，從其BC1F4后代群體中篩選出2個穩定的抗白粉病株系CHadd 7001和CHadd 7002，并運用形態學、細胞學、抗病性、基因組原位雜交的研究方法對其進行了分析、鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料包括：從八倍體小偃麥TAI7047（2n=56）與普通小麥晉太170的BC1F4群體中選育出的2個穩定株系CHadd 7001和CHadd 7002；二倍體擬鵝冠草（St基因組）；中國春。

1.2 方法

1.2.1 制片 在24℃恒溫箱中將種子培養至露白，4℃冰箱中處理24 h，再轉移到24℃恒溫箱中培養，待根長1.5～2.0 cm時，剪取生長健壯的根尖，冰水處理24 h，卡諾固定液I固定。檢測時，根尖用0.2mol/L鹽酸室溫解離8 h以上，45%醋酸壓片，相差顯微鏡下進行觀察[6]。挑選中期分裂相多且分散好的片子，液氮冷凍揭片，氣干，置于干燥潔凈的載玻片貯藏盒中，-20℃保存備用。

1.2.2 基因組總DNA的提取 采用CTAB法[7]提取基因組DNA，略有改動。

1.2.3 封阻DNA和探針DNA的制備 以普通小麥中國春的基因組DNA作為封阻DNA，以地高辛標記的二倍體擬鵝冠草（St基因組）的基因組DNA作為探針DNA。

1.2.4 基因組原位雜交（GISH）

1.2.4.1 預處理 滴加100μL 70%的甲酰胺，80℃處理2min。依次放到-20℃預冷的不同梯度酒精中（70%，95%，100%）各5min。處理完將片子夾出，使其自然干燥。

1.2.4.2 配置雜交液 去離子甲酰胺7.5μL；20×SSC 1.5μL；ssDNA 1.5 μL；50%DS 3 μL；封阻DNA 1μL；Probe DNA 1μL。上述體系配置完成后，瞬時離心（閉光），然后80℃變性10min。變性完后，迅速放到冰上處理5min以上。

1.2.4.3 雜交 把1.2.4.2雜交液15μL滴加到載玻片上的染色體處，蓋上蓋玻片，然后在周圍涂上無色指甲油保溫密封。放入濕潤的盒子里37℃反應8 h以上。用鑷子將指甲油剝掉，將標本片浸入2×SSC染色缸中，輕輕搖動使蓋片脫落，清洗20min，然后在1×PBS處理5min。離心管中加入0.5%小牛血清100μL，再加入0.5μL Antidigoxigenin Fab Fragments，渦旋混勻，滴加到蓋片上，蓋上蓋片，37℃條件下反應45min。

1.2.4.4 清洗 將片子放入1×PBS中，輕搖使蓋玻片脫落，后用1×PBS清洗3次，每次5min。清洗好的片子在室溫下氣干，加上1滴含有1μg/mL Propidium iodide（PI）的抗褪色劑，蓋上蓋玻片。

1.2.4.5 鏡檢及照相 鏡檢在Leica DM RA2熒光顯微鏡下進行，熒光信號分別采用藍色（B）激發濾光片組和綠色（G）激發濾光片組檢測。經PI染色后，檢測到已標記的探針雜交信號應為黃色或黃綠色，其他染色體為橙紅色。圖像用Leica DFC 500采集。

2 結果與分析

本研究以普通小麥晉太170為受體親本，采用回交轉育法，以八倍體小偃麥TAI 7047作為轉移中間偃麥草基因組有益基因的橋梁材料，將中間偃麥草的抗白粉病基因導入普通小麥中。通過對轉育的自交后代BC1F4進行抗病性鑒定，從47個株系中篩選出2個對小麥白粉病免疫的株系CHadd 7001和CHadd 7002，說明TAI7047所攜帶的中間偃麥草的抗病基因已成功導入普通小麥中。有絲分裂結果表明，這2個株系的染色體數目均為2n=44，因此可以初步判斷為2個小麥-中間偃麥草的抗白粉病異附加系[6]。

采用地高辛標記的二倍體擬鵝冠草基因組DNA作探針、普通小麥中國春基因組DNA作封阻，進行熒光原位雜交，GISH的結果表明，CHadd 7001和CHadd 7002株系中已分別成功導入1對中間偃麥草的染色體，即圖中檢測到探針雜交信號為黃色或黃綠色的染色體；而其他染色體上未檢測到雜交信號，呈橙紅色（圖1，2）。從圖1，2可以看出，雜交信號出現在染色體的不同位置。其中，CHadd 7001附加的外源染色體上，黃綠色的雜交信號出現在著絲點位置附近，由此可知，其所附加的外源染色體來自中間偃麥草的Js組染色體；而CHadd 7002附加的染色體雜交信號出現在兩臂的端部位置，由此可知，其所附加的外源染色體來自中間偃麥草的J組染色體[8]。根據根尖細胞有絲分裂核型分析、減數分裂結果、GISH帶型和雜交信號的分布，得出CHadd 7001和CHadd 7002為2個不同的小麥-中間偃麥草雙體異附加系。

3 討論

基因組原位雜交是20世紀80年代末發展起來的一種以親本之一的總基因組DNA作探針，另一親本的基因組DNA作封阻的原位雜交技術。它可以有效分析遠緣雜交后代染色體組的組成；系統研究多倍體中基因組之間的親緣關系、基因組的組成及起源；準確鑒定附加系、代換系和易位系，并對其中外源染色體或染色體片段的來源、大小、數目及發生位點進行檢測和定位[9]。在應用GISH檢測八倍體小偃麥及其衍生品系過程當中，通常使用二倍體擬鵝冠草基因組DNA作探針，這種探針既與小麥基因組遠同源，又能同時分辨出 JJsS（EeEbSt）3 個基因組[10-11]。

本研究從八倍體小偃麥TAI 7047與普通小麥的雜交后代中選育了2個小麥-中間偃麥草異附加系CHadd 7001與CHadd 7002，它們均來自1對親本的雜交后代，遺傳背景簡單，在遺傳學研究中具有一定的利用價值。由于這2個附加系均免疫當前我國流行的白粉病菌E09，E21，E26等生理小種，農藝性狀接近小麥親本（親本晉太170農藝性狀好，品質優良，生產上有較大推廣面積），因此，可以作為小麥抗病育種的新抗源，也可與普通小麥進一步回交來創造抗病代換系和易位系。

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［3］ 王黎明，李萍，王合堅，等.早熟型小麥種質系山農0057的細胞學鑒定[J].河南農業科學，2007（10）：27-29.

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［6］ 張曉軍，暢志堅，張名昌，等.抗白粉病小偃麥異附加系的選育及細胞學鑒定[J].山西農業科學，2009，37（4）：10-13.

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［9］ 吉萬全，薛秀莊，王長有.中間偃麥草的GISH分析[J].西北植物學報，2001，21（3）：401-405.

［10］ 陸坤，徐柱，劉朝，等.St基因組中的CRW同源序列在偃麥草中的 FISH 分析[J].遺傳，2009，31（11）：1141-1148.

［11］ Wang R R，Zhang X Y.Characterization of the translocated chromosome using fluorescence in situ hybridization and random amplified polymorphic DNA on two Triticum aestivum-Thinopyrum intermedium translocation lines resistant to wheatstreakmosaic or barley yellow dwarf virus[J].ChromosomeResearch，1996，4（8）：583-587.