殼聚糖鼻腔給藥毒性研究

陳新梅

(山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

鼻腔給藥作為一種新的給藥途徑日益受到人們的關注，鼻腔給藥對蛋白質、多肽類藥物、基因藥物、口服難吸收藥物及口服有首過效應的藥物是一種有前景的給藥途徑［1］。由于鼻腔纖毛的清除功能，藥液在鼻腔的滯留時間僅15～30min，粉末和顆粒在鼻腔的總接觸時間是20～30min，在一定程度上影響了藥物的吸收和療效。為降低鼻腔清除率，延長藥物滯留時間來增加吸收量，常加入生物黏附劑［2］，如CMC－Na、HPMC、明膠、淀粉、殼聚糖等，其中殼聚糖［3］以生物相容性好、毒性低、可控制藥物的釋放、改善易降解物質的生物利用度、增強親水性藥物通過上皮層的滲透性等優勢在藥劑學中得到廣泛應用［3］。殼聚糖的脫乙酰度，即殼聚糖分子中脫除乙酰基的糖殘基數占殼聚糖分子中總的糖殘基數的百分數，是評價殼聚糖質量的一個重要指標，直接關系到殼聚糖在稀酸中的溶解能力、富集離子的能力、離子交換能力等。本試驗考察了不同脫乙酰度的殼聚糖的鼻腔毒性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AO(雙目)光學顯微鏡(American Optical公司);ASP300型自動脫水機(LEICA公司);EG1160型包埋機(LEICA公司);RM2135型切片機(LEICA公司);鼻腔給藥噴霧瓶(蘇州萬通定量閥公司)。

1.2 藥品與試劑 殼聚糖(山東奧康生物科技有限公司，脫乙酰度分別為 82.8%、85.4%、88.5%、91.1%、92.1%、95.4%);去氧膽酸鈉(生化純，上海伯奧生物科技有限公司，批號:030208)。其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 健康成年SD大鼠，雌性，體重(250±50)g;蟾蜍45～85 g，雌雄兼用。所有動物均由山東中醫藥大學動物中心提供，動物證號:SYXK(魯)20050043。

2 方法

2.1 在體蟾蜍上腭法研究殼聚糖對纖毛運動的影響 將蟾蜍仰臥固定，用止血鉗牽拉，使口腔張開，于上腭粘膜處滴加藥液0.5mL，使藥液完全浸沒上腭，接觸30min后，用生理鹽水洗凈藥物，分離蟾蜍兩眼之間的粘膜，面積為3mm×3mm，用生理鹽水洗凈血塊及雜物，粘膜面向上，平鋪于載玻片上，于粘膜表面滴加生理鹽水0.2mL，蓋上蓋玻片，于10×45倍光學顯微鏡下觀察纖毛運動情況，隨后置于加有少量蒸餾水的密閉容器中，密閉，使水蒸氣近飽和狀態，環境溫度保持在20～25℃。每隔適當時間取出，顯微鏡觀察，直到纖毛停止運動。記錄從開始給藥到纖毛完全停止運動所需要的時間。另取蟾蜍如上操作，滴加生理鹽水(Physiological saline)0.5mL作為陰性對照。以公認的具有纖毛毒性的1%去氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)作為陽性對照，考察6種不同脫乙酰度的殼聚糖溶液(Chitosan solution)的鼻腔毒性。以給藥組蟾蜍的纖毛持續運動時間除以生理鹽水組蟾蜍的纖毛持續運動時間，得到纖毛持續運動時間相對百分率。相對百分率越高，藥物的纖毛毒性越小。

2.2 殼聚糖對大鼠鼻腔粘膜形態學的影響 健康SD大鼠，雌性，分為9組，每組3只。大鼠用乙醚輕微麻醉后，分別鼻腔給予生理鹽水、1%去氧膽酸鈉、6種不同脫乙酰度的0.25%殼聚糖溶液、1%冰醋酸。每100g體重給予0.1mL，每日3次，連續7 d，第8天股動脈放血處死大鼠，立即取鼻中隔粘膜，用定量生理鹽水沖洗。取下粘膜置中性甲醛液中，固定，經脫水處理后，石蠟包埋，切片3～5μm，蘇木精－伊紅染色，在光學顯微鏡下觀察鼻粘膜組織結構的改變。

3 結果

3.1 殼聚糖對蟾蜍上腭纖毛運動時間的影響［4］殼聚糖對纖毛運動時間的影響見表1。作為陽性對照的1%去氧膽酸鈉在30min內使纖毛運動停止。各種脫乙酰度的殼聚糖對纖毛的擺動時間影響不同。2、3、4、6號基本無影響，1號和5號未發現纖毛運動，估計原因為蟾蜍放置時間過久(由大鼠鼻腔切片可進一步證明所有殼聚糖都無毒性)。由表1可以得出結論:0.25%殼聚糖溶液對纖毛擺動時間基本沒有影響。

表1 殼聚糖對在體蟾蜍纖毛運動時間的影響

蟾蜍上腭粘膜給0.25%殼聚糖溶液后顯微鏡下觀察的結果見圖1。在顯微鏡下，可直觀的觀察到蟾蜍上腭黏膜纖毛的擺動，尤其在黏膜的邊緣更加清晰，如圖1箭頭所示。

圖1 蟾蜍上腭粘膜給0.25%殼聚糖后顯微鏡下結果(×400)

3.2 殼聚糖對大鼠鼻腔粘膜形態學的影響［5］根據藥物對鼻腔粘膜的刺激作用，將藥物對鼻腔粘膜的刺激作用分為3個級別:輕度、中度和重度。評判標準如下:

輕度:粘膜上皮細胞完整，粘膜下少量炎細胞浸潤。

中度:粘膜上皮細胞水腫，粘膜下炎細胞浸潤。

重度:粘膜上皮細胞變性壞死，大量炎細胞浸潤。

經本次實驗驗證，去氧膽酸鈉組為重度刺激，生理鹽水組、1%冰醋酸組、6種脫乙酰度的0.25%殼聚糖組為輕度刺激。說明0.25%殼聚糖對大鼠鼻腔粘膜無黏膜毒性，結果見圖2。

圖2 大鼠鼻粘膜切片圖(×100)

4 討論

研究藥物鼻腔纖毛毒性的動物模型有雞胚氣管的粘膜纖毛和蟾蜍上腭粘膜纖毛，后者與哺乳動物鼻粘膜纖毛在組織上相似，且材料易得，操作簡便，故應用較廣。本次實驗以在體蟾蜍上腭為模型，觀察了殼聚糖對纖毛運動的影響。實驗結果證明:脫乙酰度為 82.8%、85.4%、88.5%、91.1%、92.1%、95.4%的0.25%殼聚糖溶液對纖毛毒性很小或可看做無纖毛毒性。此外，蟾蜍體重大小、給藥量的多少、所取粘膜的位置及標本制作時間是影響在體蟾蜍上腭模型法測定結果準確性及重復性的主要因素。如本次實驗由于動物房提供蟾蜍不是很方便，一次買來的10只蟾蜍在每天做2只的情況下最后2只纖毛未發現運動，估計原因是在不適合蟾蜍生存的實驗室環境放置過久。另外在實驗中發現，即使在飽和水蒸氣的密閉容器中放置切片，仍需要不定時的在蓋玻片邊緣滴加少量生理鹽水，因為切片要經常的取出在顯微鏡下觀看，觀看時水分的蒸發會導致切片失去水分，因失水導致纖毛提前停止運動會影響最后的實驗數據。在裝片前應將蟾蜍上腭表皮外的一層粘稠物質除去，裝片應使粘膜外層朝上，否則不易觀察。

鼻粘膜毒性最直觀的評價方法是用顯微鏡觀察給藥后粘膜細胞組織結構的變化及表面纖毛的形態變化。殼聚糖對大鼠鼻腔粘膜形態學影響的實驗證明:脫乙酰度為82.8%、85.4%、88.5%、91.1%、92.1%、95.4% 的 0.25% 殼聚糖對大鼠鼻粘膜無毒性。

本實驗結果證明:不同脫乙酰度的殼聚糖溶液均無鼻腔毒性，因此殼聚糖可作為鼻腔給藥的輔料，在鼻腔給藥系統中廣泛應用。

［1］陳新梅.用于全身治療的鼻腔給藥系統研究概況［J］.中國現代應用藥學，2007，24(1):23 －27.

［2］陳新梅.生物粘附性粉末在鼻腔給藥中的應用新進展［J］.中國藥業，2009，18(17):76 －77.

［3］陳新梅，李心沁.殼聚糖載體對藥物鼻腔吸收的促進作用［J］.中國臨床藥理學與治療學，2008，13(9):981－984.

［4］王優，高永良.G－2407－3鼻腔噴霧劑及其輔料對鼻黏膜纖毛運動的影響［J］.解放軍藥學學報，2010，26(1):7－9.

［5］楊艷偉，林志，李珊珊，等.大、小鼠鼻腔毒性病理檢查標本制片方法的探討［J］，中國新藥雜志，2009，18(7):646－648.