不同組別腦膠質瘤CD133/PCNA和Nestin/PCNA雙染共表達及其臨床意義

郭成永，焦保華，梁朝輝，盧圣奎

（河北醫科大學第二醫院神經外科，河北石家莊 050000）

不同組別腦膠質瘤CD133/PCNA和Nestin/PCNA雙染共表達及其臨床意義

郭成永，焦保華*，梁朝輝，盧圣奎

（河北醫科大學第二醫院神經外科，河北石家莊 050000）

目的探討腦膠質瘤組織中CD133陽性細胞及NeStin陽性細胞增殖指數的共表達情況及其臨床意義。方法免疫組織化學雙染色方法檢測CD133/增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及NeStin/PCNA在不同級別腦膠質瘤中共表達情況，并對它們之間的關系進行分析。結果CD133/PCNA和NeStin/ PCNA在腦膠質瘤中，高級別組（III，IV級）表達高于低級別組（I，II級），差異有統計學意義（P＜0.05）。結論CD133/PCNA和NeStin/PCNA在腦膠質瘤中的表達情況隨著腫瘤惡性程度的增高而增強，病理級別越高，表達越強。

神經膠質瘤；免疫組織化學；臨床方案

膠質瘤占中樞神經系統腫瘤的40.49%，其生長特點為浸潤性生長，與正常腦組織無明顯界限，可累及多個腦葉，針對腦膠質瘤雖然給予了積極的手術及放化療治療，仍很難避免其復發，危及患者生命。因此尋找腦膠質瘤特異性治療靶點及治療策略的改變勢在必行。Singh等［1］研究發現具有干細胞標志物CD133的腫瘤細胞在腦腫瘤發生、發展過程中起重要作用，是形成不同分化程度腫瘤細胞和促使腫瘤不斷生長的根源，從而稱之為腦腫瘤干細胞（brain tumor Stem cell）。膠質瘤中腫瘤干細胞與放化療抗拒性密切相關，是惡性膠質瘤治療失敗的主要原因。CD133和NeStin是人們最常用的膠質瘤干/祖細胞標記物［2］，而增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作為腫瘤細胞增殖狀態的指標，廣泛應用于增殖程度評價［3］。本研究通過比較CD133與PCNA和NeStin與PCNA在不同級別膠質瘤中的共表達來研究膠質瘤干細胞的增殖指數，探索膠質瘤干細胞對腫瘤組織增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 病例資料：本研究所用95例標本均取自河北醫科大學第二醫神經外科200S—2009年手術切除人腦膠質瘤組織，所有標本均經病理檢查確診。

1.2 主要試劑與儀器設備：兔抗人CD133多克隆抗體（濃縮型，博奧森）；鼠抗人NeStin單克隆抗體（濃縮型，北京中杉）；鼠抗人PCNA單克隆抗體（濃縮型，北京中杉）；SP免疫組織化學試劑盒購于河北博海生物公司；DAB顯色劑，堿性磷酸酶底物5-溴-4-氨-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍顯色濃縮液購于北京中杉生物技術有限公司公司。光學顯微鏡（Leica）及光學顯微鏡照相系統（olympuS）；石蠟自動包埋脫水機，連續切片機（Leica）切片。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色：石蠟切片，按常規SP法進行免疫組織化學染色，CD133一抗（1∶100），NeStin（1∶100），用PBS液代替一抗作陰性對照，DAB顯色，復染，高倍顯微鏡下觀察結果。

1.3.2 雙重免疫組織化學染色：95例均在另一部分研究中進行CD133、NeStin表達的檢測，其中證實存在CD133表達的62例膠質瘤標本納入本研究進行CD133/PCNA共表達研究（參照WHO 2007年中樞神經系統腫瘤分類標準［4］）其中WHOⅠ級、WHOⅡ級為低級別，計21例；WHOⅢ級、WHOⅣ級為高級別，計41例。在另一部分實驗中證實存在NeStin表達的70例腦膠質瘤標本納入本研究進行NeStin/PCNA共表達研究（參照2007年WHO神經系統腫瘤分類分級標準）其中WHOⅠ級、WHOⅡ級為低級別，計23例，WHOⅢ級、WHOⅣ級為高級別，計47例。由于所購一抗部分為同一來源試劑，所以均采用間接二步法進行免疫雙染色。石蠟切片常規脫蠟水化，切片置于枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸（120℃，15～20 min）進行抗原修復，冷卻至室溫，用PBS液沖洗，血清封閉后37℃孵育0.5h，加一抗后，4℃過夜，第2天PBS漂洗，加二抗37℃孵育0.5h，PBS漂洗，加三抗37℃孵育0.5h，DAB顯色后，PBS漂洗，加二標一抗，4℃過夜，第3天PBS漂洗，最后加入二標二抗三抗過程同前，堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素（1∶200）顯色，復染細胞核，蒸餾水漂洗30min，9S%甘油封片，其中用PBS代替一抗作為陰性對照，9S%甘油封片觀察，染色結果封片。

1.4 結果判斷：PCNA為核抗原，定位于增殖期細胞核，以胞核出現棕褐色染色為陽性，CD133與PCNA共表達為同一細胞內胞漿或胞膜出現褐紅色，胞核出現棕褐色為陽性。NeStin與PCNA共表達為同一細胞內胞漿或胞膜出現褐紅色，胞核出現棕褐色為陽性。以上結果均在低倍鏡和高倍鏡下觀察，并在高倍鏡（×400）下隨機計數100個標記細胞，計算雙染陽性細胞數占標記細胞總數的百分比，PCNA陽性率剔除了血管內皮細胞增殖的影響，每個腫瘤標本計數3張切片，計數結果取3張切片計數結果的平均值。

1.5 統計學方法：應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 腦膠質瘤CD133/PCNA（C/P）共染陽性細胞增殖指數及其與膠質瘤病理級別的關系：低級別膠質瘤組織細胞中C/P共表達呈陰性或低表達（圖1A、B）高級別膠質瘤組織細胞中呈強的C/P共表達（圖1C，D），CD133陽性細胞增殖率，低級別膠質瘤組織中CD133陽性細胞率低于高級別膠質瘤組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 腦膠質瘤組織CD133陽性細胞增殖率及其與病理級別關系Table 1 The relationship between tumor grading and CD133-positive cell proliferation rate in gliomas （n，%）

2.2 腦膠質瘤NeStin/PCNA（N/P）共染陽性細胞增殖指數及其與膠質瘤病理級別的關系：低級別膠質瘤組織細胞中NeStin與PCNA共表達呈陰性或低表達（圖2A、B），高級別膠質瘤組織瘤細胞中呈強的NeStin與PCNA共表達（圖2C、D），NeStin陽性細胞增殖率在低級別膠質瘤組織中NeStin陽性細胞率低于高級別膠質瘤組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 腦膠質瘤組織Nestin陽性細胞增殖率及其與病理級別關系Table 2 The relationship between tumor grading and Nestin-positive cell proliferation rate in gliomas （n，%）

3 討 論

長期以來，膠質瘤的病因、起源和治療一直是神經外科領域研究的熱點問題，存在多種假說和爭議，至今仍無明確的結論，而腦膠質瘤干細胞假說的發現，為膠質瘤的起源提供了新的思路［5］。該學說認為腦膠質瘤之所以能夠發生惡性生長，與腫瘤內存在少量的增殖活性旺盛的腫瘤干細胞密切相關，這些少量的具有干細胞屬性的腫瘤細胞能夠通過對稱性分裂形成子代干細胞，不對稱性分裂形成子代干細胞和腫瘤前體細胞，隨著干細胞池的逐漸擴大而形成腦腫瘤，并表達腦腫瘤干細胞特征性標志物CD133和NeStin，因此在理論上神經上皮腫瘤中NeStin或CD133的陽性細胞率能夠代表著腦腫瘤干細胞在異質性腫瘤組織內部的含量。Shibahara等［6］根據腫瘤中NeStin免疫組織化學表達的數量和強度來判斷膠質瘤的惡性程度，他們發現NeStin表達呈近血管簇狀或巢狀分布，有利于腫瘤細胞的自我更新、增殖及沿細胞間隙侵襲性生長的特性。而作為反映腫瘤干細胞特性的另外一個指標CD133，被認為是迄今為止發現的膠質瘤干細胞最重要的標記物之一，主要在干細胞及前體細胞上［7］，通過免疫組織化學的方法證實不同級別膠質瘤中CD133陽性細胞差異有統計學意義，惡性程度越高的腫瘤中CD133陽性細胞比例就越高，二者呈正相關［8］。PCNA可作為評價腫瘤細胞增殖狀態的指標，為DNA聚合酶輔助蛋白，調節DNA的合成，影響細胞增殖；同時它也是一種細胞周期調節蛋白，其表達的程度和含量能夠反映細胞增殖活性，因而PCNA已經廣泛應用于腫瘤的細胞增殖和惡性程度的判斷。查閱文獻發現［3］，通過免疫組織化學染色方法來檢測PCNA的表達，可反映細胞增殖活性，其陽性率和陽性強度與腫瘤分級、分期以及預后密切相關。

綜上所述，以上各指標均能在一定程度上和（或）不同層次上反映膠質瘤惡性增殖的生物學特性，國內外研究成功利用雙染技術來檢測CD133/ KI67共表達情況，能夠更好的反映患者預后［9］。那么作為腫瘤增殖指標的PCNA與CD133、NeStin共表達是否同樣能夠表現出其優點。本文通過免疫組織化學方法檢測了不同級別腦膠質瘤，發現在低級別組和高級別組膠質瘤中CD133/PCNA共染陽性率細胞分別為42.S6%及73.17%，經檢驗2個級別組之間差異有統計學意義，同樣NeStin/PCNA共染陽性細胞率在低級別和高級別組為47.62%和 S0.S5%，2組之間差異有統計學意義。這表明隨著膠質瘤級別增加，惡性程度增高，增殖率明顯升高，和已有文獻相一致［11］，二者呈正相關。說明在高級別的膠質瘤中細胞分化增殖和自我更新活躍，表明膠質瘤的復發有其內在必然性，我們在高級別病理標本中圖像中可見有未有陽性細胞表達的陰性標本，因腫瘤干細胞有聚居現象巢性分部，我們想是未切到干細胞分布區，NeStin/PCNA共染細胞陽性率在低級別和高級別組均高于CD133/PCNA共染細胞陽性細胞率，我們認為NeStin也是一種中樞神經系統多功能干細胞標記，因而CD133陽性細胞更具相對特異性。而這2種細胞是主要增殖細胞，在膠質瘤的發生和發展中占主要地位。CD133/PCNA或NeStin/PCNA細胞在低級別組中低表達，而在高級別組中高表達，說明在低級別組中腦腫瘤干細胞增殖力較弱或沒有增殖處于靜息狀態，而在高級別組中增殖比較活躍。在CD133和NeStin均表達的狀態下進行CD133與PCNA和NeStin與PCNA的共表達檢驗，每個實驗組中仍有非表達的情況出現，共表達率差異有統計學意義，說明即使檢測出CD133和NeStin的表達，也不能完全反映腫瘤的術后增殖和復發情況，不能為治療提供準確的反饋信息，所以可以說CD133與PCNA和NeStin與PCNA的共表達檢驗研究為臨床提供了膠質瘤更準確信息，其臨床意義比單一檢驗CD133和NeStin的表達為膠質瘤預后判斷更具有臨床實際意義。

值得注意的是，通過CD133/PCNA和NeStin/ PCNA共表達雙染技術，我們在腦膠質瘤干細胞中同樣發現了“壁龕”現象，與文獻報道相一致［11］，壁龕具有促進腫瘤微血管形成，微血管的形成又促進腫瘤干細胞惡性增殖和自我更新的特性，另外壁龕可以使處于細胞周期的停滯于G0期，處于未分化的沉寂狀態，這些因素促使腫瘤干細胞產生放化療抵抗性。

總之，通過檢測CD133/PCNA、NeStin/PCNA共表達雙染技術，有利于更準確地判斷膠質瘤生物行為和評估患者預后，CD133及NeStin作為腦腫瘤干細胞標記物在現階段具有重要意義，利用CD133/ PCNA及NeStin/PCNA的表達與腫瘤惡性程度病理級別之間的關系，研究膠質瘤的自我更新、多向分化及其致瘤能力背后的分子機制及治療抵抗性及復發的內在調控過程以及如何打破這種調控，為臨床診治提供依據，為膠質瘤干細胞的研究拓展廣度和深度。最終，開發出特異的有效的生物學方法來針對膠質瘤干細胞進行高特異性的靶向治療，那對于膠質瘤的治療將產生極大的推動。（本文圖見封三）

［1］SINGH SK，CLAIKE ID，TEIASAKI M，et a1.Identification of a cancer Stem cell in human brain tumorS［J］.Cancer IeS，2003，63（1S）：5S21-5S2S.

［2］陳驊，黃強.膠質瘤干細胞研究的新觀點［J］.中國神經腫瘤雜志，200S，6（1）：1-4.

［3］SACEHAF S，ZAIE MAHMODABDI I.ImmunnohiStochemical analySiS of P53 and PCNA expreSSion in calcifying odontogencic cySt［J］.J of Oral Scince，2010，52（4）：609-613.

［4］LOUIS DN，OHQAKI H，WIESTLEI OD，et al.The 2007 WHO claSSification of tumorS of the central nervouS SyStem［J］.Acta Neuropathol，2007，114（2）：97-109.

［5］DIIKS PB.Brain tumor Stem cell bringing order to the chaoS of brain cancer［J］.J Clin Oncol，200S，26（17）：2916-2924.

［6］SHIBAHAIA J，FUKAYAMA M.Secondary glioblaStoma with advanced neuronal immunphenotype［J］.VirchowS Arch，2005，447（3）：665-66S.

［7］BEIEI D，WISCHHUSEN J，DIETMAIEI W，et al.CD133 expreSSion and cancer Stem cellS predict prognoSiS in high-grade oligodendroglial tumorS［J］.Brain Pathology，200S，1S（3）：370-377.

［8］DENG YW，FANG JS，LI MC，et al.Correlation reSearch between cancer Stem cellS and the pathological gradeS of neuroepithelial tumorS［J］.Zhong Nan DaXue Xue Bao Yi Xue Ban，2006，31 （1）：45-51

［9］PALLINI I，IICCI VITIANI L，BANNA GL，et al.Cancer Stem cell analySiS and clinical outcome in patientS with glioblaStoma multiforme［J］.Clin Cancer IeS，200S，14（24）：S205-S212.

［10］林志雄.腫瘤發生發展的生態學原理［J］.中國神經腫瘤雜志，200S，6（4）：275-27S.

［11］李明武，牛朝詩，董永飛，等.腦腫瘤干細胞壁龕的病理學特性研究［J］.中國神經腫瘤雜志，2010，S（1）：19-25.

THE SIGNIFICANCE OF IMMUNOHISTOCHEMICAL DOUBLE STAINING OF CD133/PCNA AND Nestin/PCNA COEXPRESSION IN THE BASIC AND CLINICAL GLIOMA RESEARCH

GUO Cheng-yong，JIAO Bao-hua*，LIANG Zhao-hui，LU Sheng-kui
（Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiangzhuang 050000，China）

ObjectiveTo explore the colocalization of CD133，neStin and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in human brain glioma.MethodsImmunohiStochemical double Staining method waS uSed for determining CD133 and PCNA，NeStin and PCNA co-expreSSion in human brain gliomaS reSpectively.ResultsThe expreSSion of CD133/PCNA and NeStin/PCNA in advanced group were higher than low-grade one.The difference waS StatiStically Significant（P＜0.05）.CD133 waS poSitively correlated with PCNA.ConclusionThe expreSSion of CD133/PCNA and NeStin/NeStin/PCNA increaSe with the malignancy degree of glioma.The higher the pathological grade，the Stronger the expreSSion.

glioma；immunohiStochemiStry；clinical protocdS

I331

A

1007-3205（2011）07-0774-04

2011-01-06；

2011-05-20

郭成永（1974-），男，河北定興人，河北醫科大學第二醫院主治醫師，醫學碩士研究生，從事神經外科學膠質瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail：jiaobh2000@163.com

10.3969/j.iSSn.1007-3205.2011.07.011