6株溶磷菌和4株固氮菌混合培養條件的研究

劉青海，姚 拓，馬 從，李顯剛

（甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

早在20世紀1925年就有學者發現不同菌株組合混合培養可以形成不同的產物。研究認為混合培養能減少或避免純培養過程中生物活性下降的現象，增加培養菌生物量［1］，可以獲得更多的菌株性質。陶光燦等［2］研究了細菌組合的固氮，解磷與不同培養條件以及混合培養的研究表明，微生物之間存在著協同作用，這是一個潛能巨大的新的微生物資源，正在逐漸成為新的研究熱點。?；燮嫉龋?］對小麥根際的解磷菌、解鉀菌和固氮菌進行了互作研究發現：當兩菌株混合后，解磷菌P1616可以促進固氮菌N2106－L生長，提高了混合菌懸液中的細胞密度，解磷菌P1616還可以促進解鉀菌KL0405的生長。

溫度，pH和鹽分濃度對菌體生長影響很大，在微生物發酵的過程中要嚴格控制溫度，pH和鹽分濃度才能有最大的有效活菌數［4］。溶磷菌和固氮菌混合對溫度、pH和鹽分濃度等環境因素的響應不同，本研究旨在確定混合菌株對環境因子的適應范圍，為后續溶磷菌和固氮菌混合菌劑研制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

供試菌株為甘肅農業大學草地微生物多樣性實驗室提供的6株溶磷菌，4株固氮菌（表1）（3株聯合固氮菌和1株根瘤菌）。

表1 供試菌株及來源Table 1 List and source of tested strain

1.2 菌株間拮抗反應

分別將活化后的菌株兩兩相交劃線接種在LB平板培養基上，28℃培養2～3d，每天觀察交叉點處細菌生長狀況，若交叉點兩細菌生長弱或不生長，說明兩菌株間有拮抗作用，不適合混在一起做復合菌肥；若交叉點細菌生長良好，則說明兩菌株可以共存，之間沒有抑制作用，不發生拮抗反應的各菌株可以混合培養，可以做復合菌肥。

1.3 菌液的制備

將各供試菌株劃線接種于LB固體斜面上，28℃下培養24h，加滅菌水制成菌懸液，用UV－721紫外分光度計在D660nm下測定菌懸液濃度，并用無菌水調節D值一致后，備用。

1.4 菌株處理組合

A組 6株溶磷菌單獨培養（共計6個處理）；B組6株溶磷菌和4株固氮菌兩兩組合（共計24個處理）。

1.5 溫度條件對菌株生長的影響

（1）將LB液體培養基分裝至試管中，每管5mL，121℃滅菌30min，備用。

（2）將菌株按0.1mL接種量接種到液體試管培養基，組合菌每個菌接種0.05mL，每個菌種組合接種3管，分別標上10、15、20、25、30、35、40、45℃標記。

（3）按標記，將各試管置于相應溫度的振蕩培養箱中培養48h。

（4）取出觀察各菌株的生長情況，測定每個菌株的D660nm吸光值，并計算平均值，以確定各菌株的最適生長溫度。

1.6 初始pH對菌株生長的影響

（1）配置LB液體培養基，分裝為11份，分別采用1mol/L的NaOH和1mol/L的 HCl依次調節pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，再將LB液體培養基分裝至試管中，每管5mL，分別標上pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0標記，121℃滅菌30min，備用。

（2）將菌株菌懸液按0.1mL（單菌株）接種量接種到液體試管培養基，組合菌每個菌接種菌懸液0.05 mL（菌株組合），每個組合接種3管。

（3）將標記好的菌株置于28℃振蕩培養箱中培養48h，轉速為180r/min。

（4）取出觀察各菌株的生長情況，并測定其D660nm的平均吸光值，確定菌株及組合的最適生長pH。

1.7 鹽分對菌株生長影響

在LB培養基中加入NaCl配成1%、3%、5%、7%、9%5個濃度梯度，滅菌后制成平板備用。將配好的各處理菌懸液以劃線法接種于各鹽濃度的LB固體培養基上，每個處理3個重復，以不接種的為對照，置28℃下培養7d，觀察菌體生長情況。

2 結果與分析

2.1 拮抗測定

拮抗試驗是鑒定菌株間菌株菌能否共存的傳統方法，6株溶磷菌和4株固氮菌之間均無拮抗反應發生，各菌種可以混合培養。

2.2 溫度對菌體生長的影響

由圖1～6可以看出，溫度對單菌株和混合菌的影響較大，各供試菌株在10～45℃均能生長，但差異較顯著；各菌株或菌株組合從10～45℃的D660nm值先增加，到25℃或30℃時到達峰值，隨后開始下降，25～35℃是最佳培養溫度。

在圖1溶磷菌Jm170和根瘤菌S11組合接種在各溫度D660nm值低于單菌株Jm170和Jm170與其他固氮菌組合。在圖2～6中，Jx59＋G組合在10～45℃范圍內D660nm值均高Jx59與其他固氮菌和根瘤菌的組合，當30℃時到達峰值，為1.125；溶磷菌Lx81、Lx191、Jm92、Lx22與固氮菌和根瘤菌的組合的D660nm值在25～45℃均顯著高于Lx81單獨接菌時的D660nm值；在圖5，6中，Jm92＋W5和Lx22＋G是較優菌株組合，在10～45℃D660nm值均高于其他組合，在10℃或45℃的條件下均能正常生活，Jm92＋W5在10℃和45℃條件下的D660nm值分別為0.268和0.278，Lx22＋G在10℃和45℃條件下的D660nm值分別為0.315和0.307，菌體數量較多，可以適應高溫或低溫的不良環境。

2.3 初始pH對菌體生長的影響

從圖7～12可看出，pH對單一菌株和混合菌的生長影響較大，無論單一菌株或混合菌在pH＜4或＞9的培養液中生長緩慢或不生長，pH在6.0～8.0，大部分菌或菌株組合都可以良好生長，當pH為8.5時，Lx191＋G和Lx191＋S11生長最好，D660nm值分別為0.475、0.429?？梢赃m應較為堿性的土壤。

圖7中Jm170＋W5組合和Jm170＋G組合在pH為4.5～8.5的D660nm值顯著＞Jm170單獨培養時的D660nm值，Jm170和Jm170＋W5在pH為7.5時同時到達峰值，在峰值差異明顯，分別為0.482、0.728。在圖8中，Jx59是在pH為6.5時D660nm值達到峰值，而Jx59與固氮菌的組合在pH為7.5時D660nm值達到峰值。在圖10中，Lx81＋G在pH為6.5和7.5是D660nm值出現2個峰值，D660nm值分別0.655和0.705，均較Lx81在pH為6.5和7.5時的D660nm值0.369和0.512高。在圖10中，Lx191＋G、Lx191＋W5和Lx191＋N4等組合在pH 6.0～8.5的D660nm值顯著高于Lx191單獨培養時的D660nm值。在圖11中，Jm92＋S11組合在pH為8.0時D660nm值出現峰值，說明組合菌在堿性環境生長更良好。在圖12中，pH在6.0～8.0時，溶磷菌Lx22與固氮菌的組合D660nm值顯著高于溶磷菌單獨培養時D660nm值。圖7～12中，pH在6.0～8.0絕大多數菌和菌株組合生長良好，菌株互作可以促進菌株的生長和繁殖。由于各菌株組合在偏堿性環境可以良好生長，可以適應北方的堿性的土壤，為菌肥的開發提高有利條件。

圖1 溫度對溶磷菌Jm170和固氮菌組合生長的影響Fig.1 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Jm170）and NFB

圖2 溫度對溶磷菌Jx59和固氮菌組合生長的影響Fig.2 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Jx59）and NFB

圖3 溫度對溶磷菌Lx81和固氮菌組合生長的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Lx81）and NFB

圖4 溫度對溶磷菌Lx191和固氮菌組合生長的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Lx191）and NFB

圖5 溫度對溶磷菌Jm92和固氮菌組合生長的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Jm92）and NFB

圖6 溫度對溶磷菌Lx22和固氮菌組合生長的影響Fig.6 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Lx22）and NFB

圖7 pH對溶磷菌Jm170和固氮菌組合生長的影響Fig.7 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Jm170）and NFB

圖8 pH對溶磷菌Jx59和固氮菌組合生長的影響Fig.8 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Jx59）and NFB

圖9 pH對溶磷菌Lx81和固氮菌組合生長的影響Fig.9 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Lx81）and NFB

圖10 pH對溶磷菌Lx191和固氮菌組合生長的影響Fig.10 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Lx191）and NFB

圖11 pH對溶磷菌Jm92和固氮菌組合生長的影響Fig.11 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Jm92）and NFB

圖12 pH對溶磷菌Lx22和固氮菌組合生長的影響Fig.12 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Lx22）and NFB

2.4 鹽分對細菌生長的影響

試驗結果顯示，不論單一菌株還是菌株組合均能在1%NaCl的培養基上生長良好，隨鹽分濃度的升高，菌株及菌株組合或能生長或生長一般或生長良好。但在9%NaCl濃度下，各處理均不能生長。在3%NaCl濃度下，溶磷菌只有Lx81能良好生長，其他菌都生長一般，菌株組合中Jm170＋W5、Jx59＋W5、Jx59＋G、Lx81＋W5、Lx81＋G、Lx191＋W5、Jm92＋N4和Lx22＋G等7個組合能生長良好，比單一菌株生長好。在5%NaCl濃度下，組合中只有Lx191＋W5能良好生長，而Jm170＋S11、Jx59＋N4、Jm92、Lx22＋S11不能生長，Jm170、Jm170＋W5、Lx81、Lx81＋G、Lx191＋G生長一般，其他菌株組合生長較差。在7%NaCl濃度下，單一菌株中只有Jm170、Jx59生長較差，其他單一菌株均不能生長，而組合菌中Lx81＋W5、Lx191＋W5、Jm92＋W5生長一般，Jm170＋W5、Jm170＋N4、Lx81＋N4、Lx81＋G、Jm92＋N4、Jm92＋G、Lx22＋W5、Lx22＋G可以生長，比它們單獨培養耐鹽性強。菌株互作可以促生菌的耐鹽性，大部分菌株組合都可以耐受7%NaCl濃度，有較強的耐鹽性，對甘肅鹽堿性土壤條件具有一定的適應性，有利于開發適宜甘肅省的微生物促生菌劑（表2）。

表2 不同鹽分濃度對各菌株及其組合生長的影響Table 2 The effect of different salt concentrations on strains and combinations

3 討論與結論

3.1 溫度條件對菌株生長的影響

溫度是影響生物有機體生長和存活最重要的因素，它可以從不同的方面對生物體內所進行的許多生物化學反應產生影響［5］，溶磷菌與固氮菌或根瘤菌混合培養后在5～45℃均可正常有活，菌株組合Jm92＋W5，Jm92＋N4、Jm92＋S11和Jm92＋G在任何溫度下D660nm值都顯著高于Jm92單獨培養時D660nm值，菌株組合可以提高培養液中的活菌數，尤其是溶磷菌和固氮菌或根瘤菌組合表現的尤為突出，固氮菌或根瘤菌能固定空氣中的氮，可以提高溶液的含氮量，為溶磷菌生長提供更多的氮素，溶磷菌與固氮菌組合可能分泌一些激素來促進他們各自的生長。溫度主要影響菌株體內酶的活性，在低溫時，酶活性較低，酶促反應也較緩慢，利用營養物質能力也較弱，從而影響細菌的生長，隨著溫度的升高，酶活性也逐漸升高，酶促反應也較快，加快了對營養物質的利用率、細菌的分化速度，從而提供了培養液中的活菌數，但溫度上升到一定程度，如超過35℃時，許多酶逐漸失活，酶促反應也開始降低，降低了對營養物質的利用率，細菌數量大量減少，當超過45℃時，大批的酶失活，菌體不能利用溶液中的營養物質，從而細菌大批死亡，溶液中的細菌數量達到最低值；溫度還會通過影響發酵液的理化性質，間接影響菌體生長［6，7］。許多研究表明，細菌的溫度培養控制在28～30℃比較適合［8］，但試驗發現，溶磷菌與固氮菌或根瘤菌組合培養時，溫度在25～35℃，培養液的菌數均可達到較高水平，從而放寬了菌肥發酵時的溫度范圍，為菌肥的生產提供理論依據。

3.2 初始pH對菌株生長的影響

培養液中不同初始pH對菌體產量影響較大，在pH＞4或＜9的培養液中均不能正常生長，培養液中的pH將影響到細菌對代謝產物的解離，引起細胞膜電荷變化，從而影響對營養物質的吸收利用，pH還影響細菌體內酶的合成，進而影響細菌對營養物質的分解利用［9］。pH過高或過低都不利于細菌的生長和代謝物質的產生，進而影響到溶磷菌、固氮菌的溶磷能力、產激素能力和固氮能力。鐘傳青［10］發現，培養時pH在7～8菌體數最多，當pH低于7或高于8時，菌體產量下降，因此，初始pH值在7～8較適合。湯春梅等［4］發現燕麥或小麥根際促生菌在中性或偏堿的條件下生長好，178、O－6、N4和X5對堿性環境適應性很強。胡子全等［11］發現一株有機磷細菌最適初始pH為8.0～9.0，在初始pH為5.5～10.0內時，pH對有機磷細菌生長影響不顯著。

試驗發現混合菌均較單一菌對pH值的耐受范圍大，Jm92＋G在初始pH為5.0～8.5菌能正常生長，活菌數較多，可以適應偏堿或偏酸的環境，提高了菌肥的生態適應性，混合菌對pH適應范圍增大，可能是由于產酸菌或產堿菌的存在，所產的酸或堿緩沖了溶液pH對菌體的傷害，從而增大了對pH的適應范圍。試驗溶磷菌和固氮菌組合，無論單一菌或混合菌均能在pH為8的堿性環境正常生長，可以適應北方鹽堿性的土壤，這為菌肥的開發提供了有利條件。

3.3 鹽分對菌株生長的影響

Na＋和Cl－是維持細胞外液滲透壓的主要離子；在細胞外液的陽離子總量中，Na＋占90%以上，在陰離子總量中，Cl－占70%。所以，NaCl在維持滲透壓方面起著重要作用。Na＋與細胞膜成分發生特異作用而增強了膜的機械強度，有利于細胞膜結構的穩定。高鹽條件下，引起菌體細胞壁和細胞質中的核質都變的更緊密，多核糖體的比例不斷上升［11］。不同的NaCl濃度下，細菌中的細胞脂肪酸的組成也不同，高鹽濃度下，細胞的脂肪酸含量不斷上升，達到一定濃度不再上升，當鹽濃度繼續增加時，細菌細胞便會發生質壁分離，細菌細胞脫水死亡［13］。

細菌的耐鹽機理較復雜，大部分人認為細菌可以合成或積累一些所謂“親合性溶質”的有機化合物，如甘油、單糖、氨基酸及其衍生物等小分子極性物質來平衡細胞內外的滲透壓，保護由于脫水而變性的蛋白質［14］。這些親和性有機化合物在細菌體內迅速合成和分解，對于不同的鹽環境有很好的適應作用。

在低鹽濃度下，各菌株和菌株組合都能良好生長，當7%NaCl濃度下，Jm170、Jx59、W5生長較差，而組合菌株中，Lx81＋W5、Lx191＋W5、Jm92＋W5生長一般，Jm170＋W5、Jm170＋N4、Lx81＋N4、Lx81＋G、Jm92＋N4、Jm92＋G可以生長，較單獨培養菌株耐鹽性強?；旌吓囵B耐鹽性增強可能是由于兩菌株混合（溶磷菌和固氮菌）能夠使小分子極性物質，如甘油、單糖、氨基酸抵抗高濃度鹽對細胞的損傷，可以從細胞外高鹽環境中獲取更多的水分，從而混合菌具有更強的耐鹽性，具體機理還有待進一步研究。組合菌的耐鹽性對西北地區鹽堿性土壤有一定適應性，對于開發適宜西北地區的PGPR混合菌肥有重要意義。

溶磷菌和固氮菌單獨培養或混合培養最適溫度在25～35℃，混合培養較單獨培養生長良好；溶磷菌和固氮菌單獨培養或混合培養最適pH在6.5～7.5，在pH 7.5～8.5偏堿性環境下，混合培養生長較好，較單獨培養耐堿性更強；菌株Lx81＋W5組合，Lx191＋W5組合和Jm92＋W5組合可以在7%的鹽濃度下正常生長，較單獨培養表現出更強的耐鹽性。

［1］李勤生，衛翔.混合培養對光合細菌生長量的影響［J］.水生生物學報，1998（6）：101－105.

［2］陶光燦，周立剛.細菌組合的固氮、解磷與抗病能力及不同培養條件的影響［D］.北京：中國農業大學，2004：46－55.

［3］常慧萍，祝凌云，姚麗娟，等.小麥根際固氮菌、解磷菌及解鉀菌的互作效應［J］.中國土壤與肥料，2008，12（4）：57－59.

［4］湯春梅，陳秀蓉，姚拓.九種根際促生菌最適培養條件初探［J］.草原與草坪，2005（3）：27－30.

［5］張曉波.草地早熟禾根際促生菌（PGPR）特性及根際微生物區系研究［D］.北京：北京林業大學，2008：58－66.

［6］方敦煌，趙玉虎，沐應祥，等.拮抗菌株GP13的基本生物學特性的研究［J］.西南農業大學學報，2002，24（4）：359－361.

［7］朱茂山，關天舒.發酵條件對生防細菌B301生長及抑菌物質產生的影響［J］.吉林農業大學學報，2008（3）：25－29.

［8］滿百膺，陳秀蓉，李振東.高寒牧草內生細菌分離培養條件的優化［J］.草原與草坪，2008（5）：27－30.

［9］張高峽，盧振祖.作物根際聯合固氮芽孢桿菌的分離鑒定及生態分布［J］.氨基酸和生物資源，1998，20（1）：12－15.

［10］鐘傳青.解磷微生物溶解磷礦粉和土壤難溶磷的特性及其溶磷方式研究［D］.南京：南京農業大學，2004：121－141.

［11］胡子全，趙海泉.一株有機解磷菌的篩選及其最佳生長條件的研究［J］.中國給水排水，2007，9（17）：28－32.

［12］劉鐵漢，周培瑾.嗜鹽微生物［J］.微生物學通報，1999，26（3）：232－233.

［13］Miller K J.Effects of temperature and sodium chloride concentrations on the phospholipid and fatty acid composition of a halotolerantPlanococcussp［J］.J Bacieriol，1985，162：263－270.

［14］米琴，張玉琴，陳義光，等.青海鹽環境下革蘭氏陽性中度嗜鹽細菌的分離及其生物學特性［J］.中國給水排水，2005，33（3）：86－89.