配伍對(duì)化瘀通脈方中丹參在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)影響*

王 萍 ，王 洋 ，，李 進(jìn) ，陳 濤 ，鄭蓓蓓

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

配伍對(duì)化瘀通脈方中丹參在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)影響*

王 萍1，王 洋1，2，李 進(jìn)2，陳 濤2，鄭蓓蓓1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

[目的]研究化瘀通脈方在大鼠體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)特征及其不同配伍對(duì)組方中有效成分在體內(nèi)吸收、分布和代謝的影響。[方法]采用 Irregular-HC18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相甲醇－1%冰醋酸（40∶60），柱溫 30℃，波長(zhǎng)280 nm，測(cè)定灌胃化瘀通脈方及其不同配伍組方后的大鼠血漿和組織中的藥物濃度，Kinetica 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。[結(jié)果]建立了同時(shí)測(cè)定大鼠血漿及組織樣品中丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛和阿魏酸四種成分的高效液相色譜（HPLC）法，該方法的精密度、穩(wěn)定性及回收率等均符合要求，線性關(guān)系良好。[結(jié)論]配伍對(duì)化瘀通脈方中丹參素在大鼠體內(nèi)吸收、分布和代謝均具有積極的影響。

化瘀通脈方；丹參；配伍；藥動(dòng)學(xué)；組織分布

多年的臨床研究證明化瘀通脈方有確切的臨床療效，主治心悸、真心痛、胸痹、中風(fēng)偏癱等以“瘀”證為主的疾病。全方由4味藥組成：丹參、雞血藤、當(dāng)歸、川芎。方中丹參祛瘀止痛，活血通絡(luò)，為君藥。雞血藤補(bǔ)血活血通絡(luò)，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，兩藥合用，共助君藥活血通絡(luò)，祛瘀止痛，又可補(bǔ)血達(dá)祛瘀而不傷正之功，為臣藥。川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛，為血中之氣藥，既可助君以活血行氣，通絡(luò)止痛，又以其辛溫走竄之性，使諸藥速達(dá)病所，為佐使藥。全方藥味精專，剛?cè)嵯酀?jì)，動(dòng)靜相伍，祛瘀而不傷正，切中病機(jī)，力專而效著。

丹參素、丹酚酸B和原兒茶醛為君藥丹參的主要藥效成分，而阿魏酸則為臣藥當(dāng)歸和佐使藥川芎的共有藥效成分。因此本研究以丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛和阿魏酸為檢測(cè)指標(biāo)，運(yùn)用現(xiàn)代藥物分析手段對(duì)口服給予化瘀通脈方后在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，旨在探討方中主要有效成分在體內(nèi)的吸收、分布和代謝規(guī)律，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-20A型高效液相色譜（HPLC）儀，紫外檢測(cè)器，TGL-16臺(tái)式高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠），XW-80A微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），N-EVAPTM 111氮吹儀，P30TC空氣泵（美國(guó)）。

1.2 藥品和試劑 丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：111562-200605），丹參素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110855-200504），原兒茶醛標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110810-200506），阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110773-200611），以上標(biāo)準(zhǔn)品均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。藥材丹參、當(dāng)歸、雞血藤和川芎均購(gòu)于安國(guó)藥材基地，由天津中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室馬琳教授鑒定。甲醇（色譜純）、丙酮、冰醋酸（分析純），肝素鈉注射液，水為純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠80只，體質(zhì)量（200±10）g由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證編號(hào)：SCXK（京）2009-0004。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱為Irregular-H C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸（40∶60），流速1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參素3.90mg，原兒茶醛2.03mg，阿魏酸2.10mg，丹酚酸B 6.16mg，分別用50%甲醇溶解，并定容至10mL作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

精密量取以上4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各2mL至同一10mL量瓶中，用50%甲醇稀釋定容至刻度作為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再用50%甲醇依次稀釋成7個(gè)系列濃度，備用。

2.2.2 灌胃藥液的制備 君藥（君藥組）：丹參50 g。君藥+臣藥（君臣組）：丹參 50 g，當(dāng)歸 50 g，雞血藤100 g?；鐾}方（全方組）：丹參50 g，當(dāng)歸50 g，雞血藤100 g，川芎50 g。

將以上3組灌胃藥分別加10倍量水浸泡0.5 h，回流提取2次，第1次1.5 h，第2次1 h，濾過(guò)藥渣，合并兩次濾液濃縮至100mL藥液，80%乙醇醇沉24 h，減壓濃縮回收乙醇，定容至100mL，4℃冷藏，備用。

2.3 血漿樣品及組織樣品采集與前處理 將30只健康大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3個(gè)給藥組，即君藥組、君臣組、全方組，每組10只。再將每個(gè)給藥組分為5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，每組2只交叉取血。給藥前禁食12 h，自由飲水。按10mL/kg的劑量灌胃給藥，分別于給藥前及給藥后 0.167、0.333、0.50、0.75、1.0、1.5、3.0、5.0、8.0 和 12 h 從大鼠眼眶后靜脈叢取血約0.5mL，至肝素抗凝管中，6000 r/min離心10min，分離血漿，于-20℃保存，待用。

將48只健康大鼠隨機(jī)分為2個(gè)給藥組，即君藥組和全方組，每組24只。再將每個(gè)給藥組分為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，每組8只。給藥前禁食12 h，自由飲水。按10mL/kg的劑量灌胃給藥，分別于給藥前及給藥后 0.167、0.333、0.50、0.75、1.0、1.5、3.0 和 5.0 h 從大鼠眼眶后靜脈叢取血約0.5mL，脫臼處死，排除瘀血，取出心臟和全腦，用生理鹽水洗凈表面瘀血，剝離大腦表面血管膜，吸干表面水分，稱質(zhì)量，加入2倍量生理鹽水，充分勻漿。于-20℃保存，待用。

分別取大鼠血漿和組織勻漿液200μL置于10mL具塞離心管中，加入丙酮400μL，渦旋混合4min，10 000 r/min離心10min，準(zhǔn)確移取上清液400μL，于45℃氮?dú)饬飨麓蹈桑瑲埩粑镆?00μL甲醇溶解，渦旋混合2min，12 000 r/min離心10min，取上清液進(jìn)高效液相色譜系統(tǒng)，進(jìn)樣量20μL。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性 圖1為空白血樣、空白血樣加混合對(duì)照品溶液及實(shí)測(cè)大鼠血漿樣品的HPLC圖?？梢?jiàn)，血樣中的內(nèi)源性物質(zhì)及其他入血成分均能與待測(cè)物達(dá)到良好分離，不干擾樣品的測(cè)定，丹參素、原兒茶醛、阿魏酸和丹酚酸B的保留時(shí)間分別為3.378、4.637、9.788和 19.378min 左右。

3.2 血漿樣品測(cè)定結(jié)果 對(duì)大鼠灌胃君藥、君藥+臣藥和全方后的血漿樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，運(yùn)用Kinetica5.0軟件，采用統(tǒng)計(jì)矩法按照非房室模型擬合以下藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：最大血藥濃度（Cmax）、達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、藥—時(shí)曲線下面積（AUC0-∞）、平均滯留時(shí)間（MRT0-∞）、半衰期（T1/2）。結(jié)果見(jiàn)表 1～4。

表1 君藥、君藥+臣藥和全方給藥丹參素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s,n=5）Tab.1 Pharmacokinetic parametersof Danshensu in rat plasma（±s,n=5）

表1 君藥、君藥+臣藥和全方給藥丹參素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s,n=5）Tab.1 Pharmacokinetic parametersof Danshensu in rat plasma（±s,n=5）

組別Cmax（mg/L)Tmax（h）AUC0-∞（mg·h/L）MRT0-∞（h）T1/2（h）君藥 41.38±10.87 0.167±0.074 542.7±103.6 13.81±2.984 9.320±2.245君藥+臣藥 41.13± 9.432 0.167±0.000 521.7± 93.83 13.33±2.746 9.004±2.819全方 49.87±11.44 0.167±0.074 678.3±121.50 14.55±2.537 9.743±2.459

表2 君藥、君藥+臣藥和全方給藥丹酚酸B藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s,n=5）Tab.2 Pharmacokinetic parametersof Salvianolic acid B in rat plasma（±s,n=5）

表2 君藥、君藥+臣藥和全方給藥丹酚酸B藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s,n=5）Tab.2 Pharmacokinetic parametersof Salvianolic acid B in rat plasma（±s,n=5）

組別Cmax（mg/L)Tmax（h）AUC0-∞（mg·h/L）MRT0-∞（h）T1/2（h）君藥 71.78±12.83 0.167±0.074 299.3±105.3 5.840±1.328 4.388±0.887君藥+臣藥 73.16±11.49 0.167±0.000 370.9±104.8 6.303±1.527 4.500±0.693全方 86.61±16.67 0.333±0.075 554.6±110.4 8.968±2.095 6.478±1.027

表3 君藥、君藥+臣藥和全方給藥原兒茶醛藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s,n=5）Tab.3 Pharmacokinetic parametersof Protocatechuic aldehyde in rat plasma（±s,n=5）

表3 君藥、君藥+臣藥和全方給藥原兒茶醛藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s,n=5）Tab.3 Pharmacokinetic parametersof Protocatechuic aldehyde in rat plasma（±s,n=5）

組別Cmax（mg/L)Tmax（h）AUC0-∞（mg·h/L）MRT0-∞（h）T1/2（h）君藥 5.160±1.253 0.333±0.000 9.688±2.683 7.124±2.044 5.046±0.849君藥+臣藥 5.232±1.421 0.333±0.000 17.56±4.837 7.571±1.921 5.307±0.667全方 6.861±1.378 0.333±0.000 33.16±7.639 11.70±2.473 8.263±1.259

表4 君藥、君藥+臣藥和全方給藥阿魏酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s,n=5）Tab.4 Pharmacokinetic parametersof Ferulaic acid in rat plasma（±s,n=5）

表4 君藥、君藥+臣藥和全方給藥阿魏酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s,n=5）Tab.4 Pharmacokinetic parametersof Ferulaic acid in rat plasma（±s,n=5）

注：“-”表示君藥中未檢測(cè)到阿魏酸。

組別Cmax（mg/L)Tmax（h）AUC0-∞（mg·h/L）MRT0-∞（h）T1/2（h）君藥 - - - - -君藥+臣藥 1.793±0.382 0.167±0.074 3.155±1.742 6.612±2.468 5.007±1.092全方 1.345±0.288 0.333±0.075 8.098±1.985 9.409±2.882 6.805±1.857

3.3 組織樣品測(cè)定結(jié)果 對(duì)大鼠灌胃君藥和全方后的腦組織和心組織樣品進(jìn)行測(cè)定，采用隨行標(biāo)準(zhǔn)品定量。從8個(gè)時(shí)間點(diǎn)中選取了6個(gè)具有代表性的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛和阿魏酸在組織中的藥物濃度與血漿中的藥物濃度相比，得到濃度的比值C/C’（腦血比或心血比）作為縱坐標(biāo)，大鼠處死的時(shí)間作為橫坐標(biāo)，對(duì)以上4種有效成分在體內(nèi)的分布規(guī)律進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖 2、圖 3。

4 討論

4.1 血漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較 本研究將大鼠灌胃給予君藥、君藥+臣藥、全方（含有的相同成分生藥量相等）后的血漿樣品的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)非房室模型擬合，得到以下丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛和阿魏酸的藥動(dòng)學(xué)特征變化規(guī)律的比較。

結(jié)果表明：丹參素、丹酚酸B和原兒茶醛吸收入血的速度均較快，而在體內(nèi)消除速率為丹參素<丹酚酸B<原兒茶醛，其中丹參素在體內(nèi)維持藥效的時(shí)間較長(zhǎng)。君藥僅與臣藥配伍對(duì)以上3種成分在體內(nèi)的吸收和消除速率沒(méi)有影響。而全方配伍后，丹參素稍有延緩消除的趨勢(shì)，吸收入血量增加；丹酚酸B的吸收和消除速率減慢，吸收入血量明顯增加；原兒茶醛的吸收和消除速率明顯減慢，吸收入血量增加。使藥的加入同時(shí)延緩了阿魏酸的吸收和消除速率，延長(zhǎng)阿魏酸在體內(nèi)的持續(xù)作用時(shí)間。臣藥當(dāng)歸和使藥川芎中雖都含有阿魏酸，但使藥的加入并沒(méi)有使阿魏酸在體內(nèi)的藥物濃度迅速增加，而是緩慢地增加和緩慢地消除，大大提高了阿魏酸在體內(nèi)的藥物濃度。這很有可能與君藥丹參中丹參素、丹酚酸B和原兒茶醛3種有效成分在化瘀通脈方中藥效作用增強(qiáng)，體內(nèi)作用時(shí)間延長(zhǎng)有關(guān)。

4.2 組織分布規(guī)律比較 結(jié)果表明：丹參素是丹參中進(jìn)入體內(nèi)分布的主要藥效成分，同時(shí)也確證了丹參作為活血藥能在心-腦系統(tǒng)發(fā)揮療效的臨床經(jīng)驗(yàn)。丹參素在體內(nèi)的大量分布一方面與其在血液循環(huán)中的濃度較高有關(guān)，另一方面可能與丹酚酸B不穩(wěn)定，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為丹參素有關(guān)[1]。而全方中的丹參素在腦組織和心組織中消除非常緩慢，在5 h左右仍保持很高的濃度，說(shuō)明全方配伍能延緩丹參素在體內(nèi)的消除，這可能與川芎引藥上行的作用有關(guān)。丹酚酸B口服給藥后在體內(nèi)很不穩(wěn)定，容易發(fā)生轉(zhuǎn)化，影響吸收，因此考慮對(duì)于單獨(dú)使用丹酚酸B制劑時(shí)應(yīng)采用注射給藥，以保證藥效。有研究[2]表明灌胃原兒茶醛單體比丹參水提物中原兒茶醛的吸收入血量高，從而提示水提液中其他成分影響原兒茶醛分布，而本研究發(fā)現(xiàn)全方配伍后，延緩了原兒茶醛的體內(nèi)消除，同時(shí)吸收入血量也有增加，但是全方中原兒茶醛在腦組織分布的藥量反而降低，懷疑是某些配伍成分對(duì)原兒茶醛透過(guò)血-腦屏障有阻礙作用。在腦組織中未檢測(cè)到阿魏酸，說(shuō)明阿魏酸不能透過(guò)血-腦屏障，這與文獻(xiàn)報(bào)道[3]相符。本研究?jī)H僅是對(duì)化瘀通脈方體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)方面一個(gè)初步探索，更加深入的配伍機(jī)制研究將在后續(xù)的工作中進(jìn)行。

[1]潘桂湘,張伯禮,高秀梅.大鼠灌服復(fù)方丹參方后血清中丹參素的測(cè)定[J].中國(guó)中藥雜志,2003,28(6):562-565.

[2]宋 敏,杭太俊,張正行.丹參提取物有效成分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和相互影響研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2007,42(3):301-307.

[3]Wang Y L,Wang LY,ChengGG,etal.Tissue distribution of ferulic acid after oral administra tion of tangkuei blood-supplementing decoction to rats[J].LishizhenMedicineandMateriamedicaResearch,2008,19(7):1800-1802.

Influence of com patibility on pharmacokinetic effectsof Danshen in Huayu Tongmaidecoction in rats

WANGPing1,WANGYang1,2,LIJin2,etal
（1.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the pharmacokineticsofHuayu Tongmaiprescription and the effectof its differentcompatibility on the absorption,distribution and metabolism of the effective components in vivo in rats.[Methods]The plasma and tissue drug levelsof ratafter intragastric administration of Huayu Tongmaiprescription were determined and its different compatibility by HPLC.Chromatographic separationwasachieved on a reversed-phase Irregular HC18column (250mm×4.6mm,5μm)at30℃,with themobile phase of methanol-1%acetic acid(40∶60).The eluentwas detected at280 nm.The resultswere analyzed by Kinetica 5.0 software.[Results]The method for simultaneous determination of Danshensu,salvianolic acid B,protocatechuic aldehyde and ferulaic acid in rat plasma and tissuewas established by HPLC.The stability,precision and recoverieswith low,middle,high concentrationswere satisfied.The linear rangeswere allgood.[Conclusion]Compatibility has the active effecton Danshen in Huayu Tongmaiprescription.

Huayu Tongmaiprescription;Danshen;compatibility;pharmacokinetics;tissue distribution

R284.2

A

1672-1519(2011)03-0244-04

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目（30672664）。

王 萍（1981-），女,碩士，助理實(shí)驗(yàn)師,從事生物藥劑學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)研究。

2011-02-24）