液體電諧振和血凝抑制試驗檢測禽流感的2種方法的對比

楊會娜,蔡家利

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院,重慶 400054)

禽流感(avian influenza,AI)是由正黏病毒科流感病A型流感病毒引起的危及禽類、小型哺乳動物和人類的一種病毒性傳染病。該病的毒型較多,變異性極強,低致病性的毒株能在短期內變成高致病性的毒株,從而給養禽業造成毀滅性災難[1-7]。禽流感病毒能與雞紅細胞發生凝集現象,即血凝,但是這種血凝現象可被特異性免疫血清所抑制,即常說的血凝抑制實驗(HI)。由于血凝反應可被特異性抗體所抑制,抗體與抗原(病毒)結合后,血凝素不能吸附于紅細胞表面的受體上,因此血凝抑制試驗可以用于鑒定病毒,以及作為適時免疫的輔助手段,能避免免疫失敗、免疫空擋及重復免疫造成的損失。血凝與血凝抑制試驗是當前最普及的監測禽流感抗體的一種方法,它對設備要求不高,但對操作者的熟練程度要求相當高,不似酶標儀等機器設備的判斷性具有直觀性和機械性[4]。液體電諧振檢測裝置是把抗原與抗體反應的特異性和石英諧振換能器對表面質量負載變化的高度敏感性相結合,通過測定發生生化反應的液體電諧振頻率的變化的一種新型壓電免疫傳感儀。當待測抗原或抗體與待檢測的識別分子相互作用而產生特異結合時,就會引起晶體表面質量產生微小變化,所結合抗原或抗體的量可以通過壓電晶體質量效應所引起的頻率變化進行表征,即通過測量抗體和抗原結合前后壓電晶體的震蕩頻率變化值,可得到敏感膜上結合抗原或抗體的量[8-10]。本研究對液體電諧振試驗和血凝抑制試驗2種檢測禽流感病毒的方法進行比較試驗,并對試驗結果進行了分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

儀器:SP312等精度頻率檢測儀(中國南京盛普儀器科技有限公司);液體電諧振傳感儀(重慶理工大學生物醫電實驗室);超聲波清潔器(無錫泰迪超聲波有限公司)。

試劑:禽流感H5亞型HI試驗抗原(重慶理工大學生物制藥實驗室);禽流感H 5亞型陽性血清(重慶市動物疫病預防與控制中心);無水乙醇(重慶川東化工集團有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 1%雞紅細胞的制備

取雞翅靜脈血若干,加1/5體積的抗凝劑(3.8%檸檬酸三鈉),混勻后,加入等體積0.01 mol/L的pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS),1 500 r/min離心處理后,棄去上清液,再加PBS洗滌3次,最后用PBS稀釋管內沉淀物,制成1%懸浮雞紅細胞,儲于4℃冰箱,每周新配。

1.2.2 微量法血凝試驗(HA)檢測AIV抗原效價

按照常規操作方法,經血凝試驗檢測,AIV抗原的效價為1∶27,回歸試驗驗證其正效價檢測的正確性。

1.2.3 血凝抑制試驗

試驗原理:禽流感病毒對雞紅細胞具有凝集作用,這種血凝作用可被特異性抗體所抑制,抗體與病毒結合后,可使血凝素不能吸附于紅細胞表面的受體上,而使紅細胞沉淀。

采用微量法血凝抑制試驗按常規操作進行,使用1%的雞紅細胞和4個HA單位的AIV病毒抗原,檢測結果以HI效價大于或等于24判為陽性。

1.2.4 1%紅細胞和禽流感病毒的液體電諧振試驗

試驗原理:在全液相條件下,液體的內在性質決定著液體的振蕩頻率。在一定環境下,當成分不變的液體不發生任何生物或者化學反應時,同時測量的傳感器不變,則其電諧振頻率是一定的。如果液體性質發生改變,那么其電諧振頻率必定變化。本實驗中檢測的就是抗原和抗體特異結合和不結合發生的諧振頻率的變化[9]。

本實驗所用到的反應芯片是一種圓形的指叉形傳感器,如圖1所示,它是由一片直徑為1.5 cm的圓狀片體組成,上面鍍有交叉、對稱且留有縫隙的鍍金極板,基頻為10 MHz。

圖1 指叉形傳感器切面

反應芯片的清洗:將超聲波清潔器中加適量去離子水,洗掉使用過的指叉形傳感器極板上的反應殘余物,再將其浸泡在盛有無水乙醇的小燒杯中,最后將小燒杯放在超聲波清潔器中,清洗1 min,取出吹干,備用。

試驗過程:

1)將潔凈的反應芯片安裝在電諧振儀上,溫度設為37℃,預熱5 min。

2)配置AIV抗原反應液。計算出含4個血凝單位的AIV抗原濃度,按如下公式進行計算:

抗原應稀釋倍數=血凝滴度/4

即用190μL的PBS稀釋6μL的AIV抗原,總體積為196μL。

3)打開SP312等精度頻率檢測儀,啟動PC機上系統操作軟件。

4)參照血凝抑制實驗的步驟,在液體電諧振儀上進行檢測,具體如下:吸取20μL已配好的AIV抗原反應液放入滅菌EP管中,再加20μL AIV陽性血清于EP管中混勻,等PC機上信號穩定后吸取20μL混液滴加在傳感器正中央反應孔上,10 min后再加10μL前面已配好的1%雞紅細胞,繼續跑曲線30 min,停止斷開操作系統,保存試驗曲線。

5)立即取出反應芯片清洗,步驟如本文1.2.4節。

6)重復以上步驟,分別檢測不同體積比例的AIV抗原反應液和陽性血清的反應曲線。

7)用標準陰性血清做空白對照,重復上述步驟。

2 試驗結果

2.1 微量法血凝和血凝抑制試驗檢測AIV的結果

經檢測AIV抗原反應液抗原的效價為1∶27,AIV抗體陽性血清的效價為1∶26。

2.2 液體電諧振儀檢測AIV的結果

經檢測得到如下曲線:圖2是AIV抗原反應液被陽性血清完全抑制,不再和1%雞紅細胞結合的反應曲線;圖3是AIV抗原反應液部分被陽性血清抑制,部分和1%雞紅細胞結合的反應曲線;圖4是陰性對照,即AIV抗原反應液被陰性血清抑制,而和1%雞紅細胞結合的反應曲線。

圖4 AIV病毒與標準陰性血清的過程反應曲線

3 討論

3.1 液體電諧振儀檢測禽流感和HI試驗方法的檢測符合率

圖2中AIV陽性血清和AIV抗原反應液的體積比為1∶1。反應的前階段是AIV反應液抗原和陽性血清中的抗體相互作用,10 min后加入紅細胞,不再有結合位點與其起作用,因此10 min后的曲線近乎平行線。

圖3中AIV陽性血清和AIV抗原反應液的體積比為1∶63,即陽性血清效價的臨界值。反應的前階段AIV抗原和抗體部分結合,10 min后加入紅細胞,未被抑制的那部分AIV抗原和紅細胞結合。反應液性質不同,引起曲線發生波動。HI方法測得的AIV陽性血清的最高效價相一致。

圖4用陰性血清做空白對照。此反應中AIV抗原沒有與其結合的抗體,所以加入紅細胞后,逐漸與紅細胞結合,反應的曲線近似斜直線,最終趨向平行線。

3.2 兩種試驗方法的相關性

無論是用HI試驗方法檢測禽流感還是用液體電諧振儀檢測禽流感,都需要事先確定禽流感抗原的效價。二者的試驗方法是一致的,不同之處在于HI的實驗結果在96孔V型微量血凝反應板上顯示,而液體電諧振儀檢測禽流感病毒可以通過PC機直觀的顯示。HI試驗方法比較成熟,但是該方法在結果判定中人為因素較大,而液體電諧振儀的結果很直觀地以曲線的形式顯示出來,5μL左右的反應液就可以進行檢測,儀器中的反應芯片清潔后可重復使用,另外可多個反應空同時檢測多個樣品可同時檢測多個樣品。

4 結束語

本實驗針對新的檢測禽流感方法做了進一步的研究,將其與目前常用的檢測方法——血凝抑制法進行對比。研究結果發現,與傳統的檢測方法比較,液體電諧振儀具有檢測速度快、靈敏、操作簡便、結果直觀等優點,未來可用于AIV的早期快速診斷和或者其他方面疾病的診斷,有一定的社會意義和經濟價值。

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