黑龍江省依蘭縣酸漿根腐病病原菌鑒定及生物學特性初步研究

王 勇 張晶晶 葉陽陽 陳 典

（東北農業大學園藝學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

酸漿（Physalis alkekengi L.）是茄科酸漿屬多年生宿根草本植物，地下根狀莖橫生，成熟漿果橙紅色或黃色，可供鮮食和觀賞（葛玉 等，2006）。在熱帶和亞熱帶地區，酸漿作為一種常用藥物被廣泛用于治療瘧疾、哮喘、肝炎、皮炎、風濕等疾病（甄清 等，2006），另外酸漿中的酸漿苦素還具有免疫調節、抗腫瘤、抗菌、強心等生物活性（許亮 等，2009）。

在酸漿大面積生產種植中，多采用一次播種連續4～5 a采收的方法（孫偉 等，2008），其根狀莖容易發生多種病害。本試驗以黑龍江省依蘭縣感病紅果酸漿〔Physalis alkekengi L.var francheti（Mast.）Makino〕的病根和地下莖為試材進行病原菌分離和鑒定，同時對致病菌的生物學特性進行了研究，旨在探討酸漿根腐病的發生發展規律，為制定綜合防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的鑒定

1.1.1 病樣采集及病原物分離培養 2008年4月～2010年10月在黑龍江省依蘭縣酸漿種植地多點采集病根及地下莖，采用組織分離法分離病原菌（方中達，1998），病樣組織接種于 PDA培養基，25 ℃恒溫培養（PDA中含終濃度為100 mg·L-1的鏈霉素以抑制細菌生長）。純化培養物，轉入凍存管中，4 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 致病性測定 將分離得到的優勢菌落在PDA平板上于25 ℃、24 h光照條件下培養5 d，采用傷口接種法，將直徑為8 mm的菌碟直接接種于苗齡為20～25 d的酸漿幼苗地上莖部位，每種菌接種30株。接種后幼苗于溫室中培養，以不接菌的植株為對照。

根腐病病情分級標準：0級：無癥狀；1級：須根變黑；2級：主根及地下莖變黑；3級：主根及地下莖變黑腐爛，地上部生長不良；4級：根部腐爛，植株死亡。

1.1.3 病原菌形態觀察 將分離出的優勢菌株接種到PDA平板上，25 ℃培養箱中光照培養5 d，肉眼觀察菌落形態特征，在光學顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗形態。根據病原菌產孢特征及其在PDA培養基上的形態特征，對病原菌進行初步鑒定。

1.1.4 病原菌產孢特征觀察 在SNA平板上接種直徑為8 mm的病原菌菌碟，25 ℃光照培養箱中培養4 d，于滴有無菌水的載玻片上挑取少量菌絲，在光學顯微鏡下觀察產孢情況。

1.1.5 病原菌 rDNA ITS擴增及序列分析 將酸漿根腐病致病菌接在 PDA培養基表面的玻璃紙上，25 ℃恒溫培養5 d，取0.1 g菌絲體，加入液氮研磨，用改良的CTAB法提取病原菌基因組總 DNA（陳昆松 等，2004）。rDNA ITS擴增采用真菌核糖體基因轉錄間隔區（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為25 μL，包括：10×PCR Buffer（含 Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 1 μL，DNA 模板 100 mg，10 μmol·L-1ITS1 和 ITS4各1 μL，5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O補足。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物在1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

測序結果經 BLAST（http：//www.ncb.inlm.nih.gov/blast）與 NCBI數據庫中的已知序列進行同源性比較，結合病原菌的形態學特征及致病性測定，確定酸漿根腐病的主要致病菌。

1.2 病原菌的生物學特性研究

將致病菌的菌株移到PDA平板上培養3～4 d后進行以下試驗。

1.2.1 不同溫度對菌落生長的影響 從上述培養的菌株菌落邊緣，用打孔器取直徑為8 mm的菌碟，接到PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃的恒溫箱中培養，第5天用十字法測量菌落生長直徑，取平均值，每處理3次重復，并記錄菌落形態、顏色變化等。

1.2.2 不同pH值對菌落生長的影響 用HCl緩沖液和NaOH緩沖液將PDA培養基pH值調成5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.06個梯度，然后將培養基滅菌。將直徑為8 mm的菌碟接到不同pH值的PDA平板上，25 ℃恒溫培養箱中培養5 d，觀察方法同1.2.1。

1.2.3 不同光照對菌落生長的影響 設置3種不同光照條件的培養箱，即24 h全光照、24 h全黑暗、12 h光照與12 h黑暗交替3種處理，培養溫度及觀察方法同1.2.2。

1.3 數據處理

數據計算借助于Excel軟件完成，百分數經反正弦平方根轉換后用SAS 6.0軟件進行方差分析。采用Clustalx和TreeView32軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 田間病害癥狀

受病原菌侵害的酸漿植株矮小，長勢弱。發病初期，地下須根感病，變少，新生的根也很稀疏，植株基部葉片由葉尖開始變黃，并逐漸向上部葉片發展。后期主根及根莖上可見黑褐色病斑，出現腐爛至病部組織變硬，裂口深及木質部。直接導致水分與營養物質中斷，最后導致整株萎蔫死亡（圖1）。

2.2 致病性測定

以酸漿感病根及地下莖為材料，進行病原菌分離。從病變組織中共分離出7種菌株，其中3號菌株與6號菌株為廣譜性青霉菌，其他均為鐮孢菌屬病原菌。為了確定主要致病菌，首先將分離出的各病原菌在PDA培養基上培養5 d，打成直徑為8 mm的菌碟進行傷口接種，定期觀察。7號菌株和4號菌株在接種9 d后，接種部位出現黑色斑點，后期植株根部出現水漬狀病斑，逐漸腐爛，地上部葉片變黃并逐漸萎蔫，與健康植株比較長勢弱（圖2）。1號菌株和2號菌株在接種13 d后也有癥狀出現，但較輕微，而5號菌株接種后沒有發病。從各致病菌回接后酸漿的發病率和病情指數可以看出（表 1），7號菌株與4號菌株為主要致病菌，將其分別命名為PHADDR07和PHADDR04。

圖1 酸漿根腐病危害癥狀

圖2 接種PHADDR07菌株和PHADDR04菌株后酸漿植株與健康植株地下部比較

從病重組織重新分離病原物，經分離純化獲得的病原菌與原接種病原菌在菌落、分生孢子等形態特征上完全一致。根據致病性測定結果及病原菌形態特征觀察（Booth，1988），初步鑒定酸漿根腐病主要致病菌為茄鐮孢菌〔Fusarium solani（Mart.）Sacc.，PHADDR07〕和尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum Schlecht.，PHADDR04）。

表1 各分離病原菌回接后酸漿的發病率和病情指數

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 病原菌的形態特征 PHADDR07菌株在PDA培養基上25 ℃恒溫培養5 d，菌落直徑為55～62 mm，菌落邊緣平滑，近圓形，氣生菌絲綿絨狀，白色至肉色，間有土黃色，培養基不變色。小型分生孢子呈卵形、洋梨形或腎形，散生，無隔或有隔；大型分生孢子為馬特形，3～5分隔，兩端較鈍圓，在菌絲頂端單生或散生。氣生菌絲上的分生孢子梗為長筒形的單瓶梗（圖3）。

圖3 PHADDR07菌株孢子形態（40×）

PHADDR04菌株在PDA培養基上25 ℃恒溫培養5 d，菌落直徑為58～70 mm，菌落呈圓形，淡粉色或洋紅色，菌落邊緣菌絲呈乳白色，培養基不變色。大型分生孢子呈美麗形，兩端漸尖，足細胞較明顯，多為2～4分隔；小型分生孢子呈卵形、橢圓形或腎形，假頭生，0～1分隔。分生孢子梗為單瓶梗，較短，單生或具分枝（圖4）。

2.3.2 致病菌的分子鑒定 以PHADDR04菌株和PHADDR07菌株的基因組DNA為模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，兩個菌株都擴增出500～600 bp大小的片段（圖5），測序后顯示 PHADDR04菌株的擴增片段為 504 bp，PHADDR07菌株的擴增片段為529 bp。將所得序列于NCBI的數據庫中進行BLAST分析，結果顯示：PHADDR07菌株的 rDNA ITS序列與F.solani的同源性達到99 %以上，而PHADDR04菌株的rDNA ITS序列與F.oxysporum的同源性達到 100 %。聚類分析結果表明（圖 6），PHADDR07菌株和PHADDR04菌株的ITS序列都與生姜（GQ121300，GQ121304）根腐病病原菌的親緣關系最為密切，說明二者可能具有相似的寄主范圍。

結合形態學觀察、致病性測定與 rDNA ITS序列分析，可以確定酸漿根腐病主要致病菌為茄鐮孢菌（F.solani）與尖鐮孢菌（F.oxysporum）。

圖5 PHADDR04菌株和PHADDR07菌株的rDNA ITS序列擴增結果

圖6 PHADDR04菌株和PHADDR07菌株的rDNA ITS序列聚類圖

2.4 病原菌生物學特性

2.4.1 溫度對菌落生長的影響 溫度對菌落生長有明顯的影響，PHADDR04菌株在10～30 ℃均能生長，25 ℃時長勢最優，顯著優于其他溫度，在低于10 ℃或高于40 ℃的條件下菌絲停止生長；PHADDR07菌株在10～35 ℃均能擴展，25～30 ℃為最適溫度域，低于10 ℃或高于38 ℃時停止生長。

2.4.2 pH值對菌落生長的影響 pH值對菌落生長有一定的影響，PHADDR04菌株與PHADDR07菌株在pH值為5.0～10.0之間均可生長，但菌落大小在最適pH值與非最適pH值下存在顯著差異。尖鐮孢菌的最適pH值為7.0，菌落直徑可達62 mm；而8.0是茄鐮孢菌的最適pH值，菌落直徑為54 mm。

2.4.3 光照對菌落生長的影響 在相同溫度與pH值的條件下，設置全光、全暗、12 h光暗交替3種不同光照處理，觀察其對菌落生長的影響。光暗交替處理PHADDR04菌株與PHADDR07菌株的生長都較全光和全暗處理快，但差異不顯著，說明光照不是影響尖鐮孢菌與茄鐮孢菌生長的主要因素。

3 結論與討論

本試驗通過病原菌的形態學觀察、致病性測定和rDNA ITS序列分析，最終確定酸漿根腐病的主要致病菌為尖鐮孢菌（F.oxysporum）和茄鐮孢菌（F.solani）。尖鐮孢菌和茄鐮孢菌是分布廣泛的土壤習居菌，侵染能力很強，二者既可單獨侵染植物，也可共同侵染導致植物發病。周洪友等（2004）報道，茄鐮孢菌和尖鐮孢菌共同作用導致沙打旺根腐病發生；而辣椒根腐病（劉麗云 等，2007）、甜瓜根腐病（楊來新 等，2004）、西瓜根腐病（耿麗華 等，2010）均由茄鐮孢菌侵染所致；尖鐮孢菌侵染可導致馬鈴薯根腐病的發生（Manici & Caputo，2009）。

本試驗對酸漿根腐病的兩種主要致病菌進行了生物學特性的初步研究，結果表明：光照對兩種主要致病菌的生長影響不大，尖鐮孢菌的最適生長溫度為25 ℃，致死溫度為40 ℃，在pH值為7.0的PDA培養基上生長良好；茄鐮孢菌在pH值為8.0、溫度域為25～30 ℃條件下長勢最優，致死溫度為38 ℃。

本試驗確定了酸漿主產區黑龍江省依蘭縣根腐病的主要致病菌，并就其生物學特性進行了初步研究，對于生產上根腐病防治具有一定的指導意義。但茄鐮孢菌和尖鐮孢菌是否存在酸漿專化型，其產孢特性如何以及孢子萌發的條件等還有待于進一步研究。

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