HPLC法測定維格列汀片中主藥和有關物質的含量

李燕，趙春才，劉艷艷（1.南京醫科大學附屬南京兒童醫院，南京市 10008；.南京安格醫藥化工有限公司，南京市 10009）

維格列汀[1]是Ⅳ型二肽基肽酶（DPP-4）抑制劑，通過與DPP-4結合形成DPP-4復合物而抑制該酶的活性，在提高胰高血糖素樣多肽（GLP）-1濃度、促使胰島B細胞產生胰島素的同時，可降低胰高血糖素濃度，從而降低血糖，且對體重無明顯影響。維格列汀片由諾華公司研發，2007年9月由歐盟委員會批準上市，商品名為Galvus。維格列汀片的含量及有關物質測定目前未見有文獻報道，為此，本文建立了高效液相色譜（HPLC）法測定其主藥和有關物質含量，為其質量評價和標準的建立提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HPLC儀，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外檢測器、UV-2401PC紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）。

1.2 試藥

維格列汀片（南京安格醫藥化工有限公司制劑室，批號：100316、100317、100318，規格：每片50 mg）；維格列汀對照品（南京安格醫藥化工有限公司合成室，由批號為100302的原料藥精制而成，含量：99.64%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.01 mol·L－1磷酸氫二鉀溶液-乙腈（75∶25）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品與對照品溶液：取樣品片劑研成的粉末適量，約相當于維格列汀25 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，過濾；取續濾液5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取維格列汀對照品，同法用流動相溶解并制成每1 mL中含125 μg的溶液作為對照品溶液。

2.2.2 有關物質溶液：取樣品片劑研成的粉末（輔料不干擾測定）適量，用流動相制成維格列汀濃度為0.25 mg·mL－1的溶液作為供試液；取該液適量，用流動相稀釋制成2.5 μg·mL－1的溶液作為對照液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2.1”項下對照品、供試品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣，并以空白輔料的流動相溶液作為陰性對照，進樣分析。結果，在上述色譜條件下，維格列汀的理論板數為7293，保留時間為7.535 min，峰形對稱，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.陰性對照；B.對照品；C.供試品；1.維格列汀Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank excipients；B.reference substance；C.test sample；1.vildagliptin

2.4 線性關系與定量限考察

取維格列汀對照品，用流動相溶解并稀釋成濃度分別為225.0、175.0、125.0、75.0、25.0 μg·mL－1的溶液，分別精密量取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜。以進樣濃度（c）為橫坐標，維格列汀的峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為A＝2.1654×104+3.5916×104c（r＝0.9999，n＝5）。表明維格列汀檢測濃度的線性范圍為25.0～225.0 μg·mL－1。以信噪比S/N＝10計算，得維格列汀定量限為8 ng。

2.5 精密度試驗

取維格列汀對照品適量，按“2.2.1”項下方法制備對照品溶液，連續進樣6次進行測定。結果，峰面積值的RSD＝0.21%。

2.6 重復性試驗

精密稱取同批樣品6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品和對照品溶液，各進樣20 μL；在上述色譜條件下，分別測定每份樣品的含量。結果平均含量為99.46%，RSD＝0.38%，表明本方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取供試品溶液1份，在0、1、2、4、6 h分別進樣20 μL，測定，以峰面積計算RSD為0.19%，結果表明，供試品溶液在6 h內相對穩定。

2.8 回收率試驗

取同批樣品，按測試濃度的80%、100%、120%3個濃度分別加入維格列汀對照品，每個濃度3份，照“2.9”項下“（1）”項方法操作，計算回收率，結果詳見表1。

2.9 樣品含量測定

（1）主藥含量：取維格列汀片研成的粉末及對照品適量，按“2.2.1”項下方法分別制備成供試品、對照品溶液。分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，并按外標法以峰面積計算含量，結果詳見表2。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 樣品中主藥及有關物質含量測定結果Tab 2 Content determination of vildagliptin and the related substances in samples

（2）有關物質含量：取維格列汀片研成的粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備成供試液和對照液。量取對照液20 μL注入液相色譜儀，調節儀器檢測靈敏度，使維格列汀峰峰高為滿量程的10%～30%；再量取供試液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜至主峰保留時間的3倍，記錄主峰和有關物質的峰面積，按1%自身對照法計算有關物質的含量，結果詳見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取維格列汀對照品及片劑研成的粉末適量，分別用流動相制備成濃度約20 μg·mL－1的對照品、供試品溶液，按紫外分光光度法[2]操作，于190～400 nm波長范圍內進行測定。結果，對照品、供試品溶液均于210、265 nm波長左右有最大吸收，但265 nm波長處響應值只有0.102，且前一步中間體在此波長下僅有末端吸收；而輔料溶液在210 nm波長處無吸收，故檢測波長選為210 nm。

3.2 流動相的選擇

通過對維格列汀及其各步中間體及破壞后樣品的測定，發現采用濃度為0.01 mol·L－1的磷酸氫二鉀溶液-乙腈（75∶25）為流動相時，維格列汀的峰形對稱，與其有關物質、各步中間體和降解產物均能得到很好的分離，但由于有關物質含量較少，所以在色譜上不能明顯表示，故未列出相應色譜圖。通過對維格列汀原料藥的分析，其純度為99.08%，通過重結晶精制，純度達到99.64%。

綜上所述，本方法操作簡便、快捷，結果準確、可靠，可有效測定維格列汀片中的主藥和有關物質的含量，適用于控制該制劑質量。

[1]樊新星，徐 珽，盧 靜，等.抗糖尿病新藥維格列汀[J].中國新藥雜志，2008，17（14）：1272.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅣA.