馬來酸桂哌齊特注射液細菌內毒素檢查方法的建立

王宗春，羅麗萍，黃硯青（武漢大學人民醫院藥學部，武漢市 430060）

馬來酸桂哌齊特注射液為無色澄明液體，臨床主要用于治療腦血管疾病（如腦動脈硬化、一過性腦缺血發作、腦血栓形成等）、心血管疾病（如冠心病、心絞痛、心肌梗死等）及外周血管性疾病。靜脈用注射劑可以通過熱原檢查法（家兔法）判斷其所含熱原的限度是否符合規定，但是該法存在操作煩瑣、費時費力及影響因素較多等缺點，而細菌內毒素檢查法具有靈敏度高、簡便易行及重現性好等優勢，已被各國藥典所采用。目前尚未有馬來酸桂哌齊特注射液細菌內毒素檢查的文獻報道，筆者參照《中國藥典》2010年版（二部）[1]以及《中國藥品檢驗標準操作規范》2005年版[2]細菌內毒素檢查法，建立了本品的細菌內毒素檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

恒溫水浴箱（江蘇南通嘉程儀器有限公司）；微量取液器（上海金林生化試劑儀器廠，規格：50～250μL）；SW-80A型旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；細菌內毒素檢查用具（廈門鱟試劑實驗廠）。

1.2 試藥

馬來酸桂哌齊特注射液（北京四環制藥有限公司，批號：20091210、20100123、20100309，規格：80 mg∶2 mL）；細菌內毒素檢查用水（BET水，廈門鱟試劑實驗廠，批號：091107）；細菌內毒素工作標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：2009-7，規格：每支10 EU）；鱟試劑（TAL，廈門鱟試劑實驗廠，批號：091149，標示靈敏度：0.5 EU·mL－1；批號：100101，標示靈敏度：0.25 EU·mL－1。湛江安度斯生物有限公司，批號：090325，標示靈敏度：0.5 EU·mL－1；批號：091124，標示靈敏度：0.25 EU·mL－1）。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值（L）的確定

細菌內毒素限值L＝K/（M·f），式中K為人每1 kg體重每1 h最大可接受的細菌內毒素劑量，注射劑為5 EU·kg－1·h－1；M為人用每1 kg體重每1 h的最大供試品劑量。按照馬來酸桂哌齊特注射液說明書中用法用量，每次4支（320 mg），稀釋于10%葡萄糖注射液或生理鹽水500 mL中，靜脈滴注，并明確規定滴注速度為100 mL·h－1（即滴注時間為5.0 h），則M＝320/（60×5.0）＝1.067 mg·kg－1·h－1（人平均體重按60 kg計）。f為安全系數，由于本品用于心腦血管類疾病，考慮到葡萄糖注射液或生理鹽水也可能含有細菌內毒素，為了嚴格質量標準和計算方便，將安全系數f定為4.7[3]。因此，本品的細菌內毒素限值L＝5/（1.067×4.7）＝1.0 EU·mg－1。

2.2 樣品最小有效稀釋濃度（c）的確定

樣品最小有效稀釋濃度c＝λ/L，其中L為細菌內毒素限值，即1.0 EU·mg－1，λ為鱟試劑靈敏度。目前市售的鱟試劑的λ常為 0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL－1，對應的樣品最小有效稀釋濃度為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg·mL－1。

2.3 TAL靈敏度復核

按《中國藥典》2010年版（二部）附錄ⅪE“細菌內毒素檢查法鱟試劑靈敏度復核項”[1]進行操作，其中陰性對照（NC）管操作方法：向分裝有0.1 mL TAL溶液的試管內加入BET水0.1 mL，依法操作，結果見表1（表中“-”表示未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁脫落，即反應呈陰性；“+”表示管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不脫落，即反應呈陽性。以下各表同）。

表1 TAL靈敏度復核結果Tab 1 The checking results of tachypleus amebocyte lysate’s sensitivity

表1結果表明，4個批號的TAL靈敏度測定值λc均在0.5 λ～2.0 λ之間，符合規定，可用于試驗。

2.4 干擾預試驗[4～6]

用BET水將馬來酸桂哌齊特注射液分別稀釋至質量濃度為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg·mL－1的系列溶液，測得pH值在6.8～7.2范圍內，符合細菌內毒素檢查的pH值要求，作為供試品陰性對照（NPC）系列。另制備同樣濃度的供試品系列溶液，使每一濃度下的供試品溶液中都含有2 λ（λ為0.5 EU·mL－1）細菌內毒素，作為供試品陽性對照（PPC）系列。每一供試品濃度重復2管，按常規設立陽性對照（PC）管和陰性對照（NC）管。用2個不同廠家生產的鱟試劑（λ為0.5 EU·mL－1）與上述系列溶液進行反應，結果見表2。

表2 樣品干擾預試驗結果Tab 2 Results of interference pretest of samples

由表2可知，2個廠家的TAL所能得到的最大不干擾濃度是一致的，即質量濃度為0.5 mg·mL－1的供試品溶液對TAL與細菌內毒素之間的凝集反應有抑制作用，但當樣品稀釋至0.25 mg·mL－1及以下濃度時，抑制作用消失。

2.5 干擾試驗

根據干擾預試驗結果，用質量濃度為0.25 mg·mL－1的供試品溶液及BET水分別稀釋細菌內毒素工作標準品，制備成細菌內毒素最終濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.06 EU·mL－1的系列溶液，分別取0.1 mL加入到已復溶的2個不同廠家生產的TAL（λ為0.25 EU·mL－1）管內，每個濃度平行做4管，另取供試品溶液做2支NC管，進行干擾試驗，結果見表3。

表3 樣品干擾試驗結果（0.25 mg·mL－1）Tab 3 Results of interference test of samples（0.25 mg·mL－1）

表3結果顯示，Et/Es在0.5～2之間（Es為用BET水制成的細菌內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值），按照《中國藥典》2010年版（二部）判斷標準，質量濃度為0.25 mg·mL－1的供試品溶液對TAL與細菌內毒素之間的凝集反應無干擾，細菌內毒素檢查法適用于馬來酸桂哌齊特注射液。

2.6 樣品細菌內毒素檢查

取3批馬來酸桂哌齊特注射液（每批各取5支），制備成質量濃度為0.25 mg·mL－1的溶液，使用2個廠家生產的TAL（靈敏度λ均為0.25 EU·mL－1），按《中國藥典》2010年版（二部）附錄細菌內毒素檢查法進行操作，并分別用BET水制備的細菌內毒素溶液（0.5 EU·mL－1）和BET水設立PC管和NC管，檢查結果見表4。

表4 樣品細菌內毒素檢查結果Tab 4 Results of bacterial endotoxins test of samples

表4結果表明，3批樣品的細菌內毒素檢查均符合規定。

3 討論

細菌內毒素檢查法中要求供試溶液的pH值在6.0～8.0范圍內，過酸、過堿的供試品需調節其pH值。因此，在試驗中用pH計測定了質量濃度為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg·mL－1的樣品的pH值，結果均在6.8～7.2之間，不需調整，可直接用于細菌內毒素檢查。

由表2干擾試驗結果可以看出，將3批樣品稀釋至質量濃度為0.25 mg·mL－1，分別使用2個不同廠家生產的TAL（靈敏度均為0.25 EU·mL－1）進行干擾試驗，其Et/Es均在0.5～2.0范圍內，說明樣品在該濃度下不干擾細菌內毒素檢查。根據以上試驗結果，確定馬來酸桂哌齊特注射液的細菌內毒素檢查方法如下：將本品稀釋至質量濃度為0.25 mg·mL－1，依照《中國藥典》2010年版（二部）附錄細菌內毒素檢查法進行檢查，細菌內毒素限值定為1.0 EU·mg－1。

綜上所述，建立的細菌內毒素檢查方法可行，可用于馬來酸桂哌齊特注射液的檢查。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄99-102.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[S].北京：中國醫藥科技出版社，2005：287.

[3]黃清泉，夏振民.藥品細菌內毒素檢查的實驗設計[J].中國藥學雜志，1997，32（2）：72.

[4]潘衛松，肖 瑛，潘建明.熒光素鈉注射液細菌內毒素檢查法的研究 [J].中國藥房，2009，20（13）：1010.

[5]劉 春，趙毓梅.馬來酸氯苯那敏注射液的細菌內毒素檢查[J].中國藥房，2009，20（25）：1990.

[6]蔡 慎，鄭英麗，陳寶玲，等.復方鉀鈣鎂液中細菌內毒素檢查法的可行性研究[J].中國藥房，2010，21（21）：1997.