RP-HPLC法同時測定復方間苯二酚洗劑中間苯二酚和苯酚的含量

崔 麗（南京市紅十字醫(yī)院藥劑科，南京市 210001）

復方間苯二酚洗劑是《中國醫(yī)院制劑規(guī)范》第2版中收載的皮膚科外用制劑，具有殺霉菌作用，臨床上用于治療霉菌性皮膚病，如手足癬、體癬、股癬等。本制劑中間苯二酚、苯酚含量測定的方法有二階導數(shù)紫外光譜法[1]、雙波長線性回歸光度法[2]、系數(shù)倍率法[3]和《中國醫(yī)院制劑規(guī)范》中規(guī)定采用的溴量法[4]。采用上述方法測定時，操作煩瑣，不能達到快速檢驗的目的，且溴量法只能測定2組分的總量，不能測定2組分各自的量。為更好地控制該制劑的質量，保證臨床用藥安全，筆者建立反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，以同時測定制劑中間苯二酚和苯酚的含量。結果表明，所建立的方法簡便、快速、準確、重復性好，可用于該制劑的質量控制。

1 儀器與試藥

LC-20AT HPLC儀、SPD-20A紫外檢測器（日本島津公司）；BS 210s電子天平（北京賽多利斯有限公司）。

復方間苯二酚洗劑（自制，批號：100402、100511、100604，規(guī)格：每瓶100 mL，其中間苯二酚含量：100 mg·mL－1，苯酚含量：37.49 mg·mL－1）；間苯二酚、苯酚標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100509-200401、100106-200303，供含量測定用）；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Hedera ODS-2（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（65∶35）；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25 ℃ ；進樣量：20 μL；靈敏度：0.02AUFS。

取“2.2”項下混合標準品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各20μL進樣，記錄色譜，結果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合標準品；B.供試品；C.陰性對照；1.間苯二酚；2.苯酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed standard substance；B.test sample；C.negative control；1.resorcinol；2.phenol

圖1結果表明，陰性對照樣品對測定無干擾。

取“2.2.2”項下混合標準品溶液20μL，按選定的色譜條件重復進樣5次，色譜參數(shù)結果見表1。

表1 色譜參數(shù)結果Tab 1 Results of chromatographic parameter

由表1可見，各參數(shù)均符合要求。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液。精密量取1 mL樣品，置于100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取稀釋液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.2 標準品溶液。分別精密稱取間苯二酚、苯酚標準品10、3.75 mg，同置于100 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中含間苯二酚0.1 mg、苯酚0.0375 mg的混合標準品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液。按處方比例制備不含間苯二酚、苯酚的陰性樣品，按“2.2.1”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 線性關系考察

（1）間苯二酚：精密稱取間苯二酚標準品50 mg，置于100 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含間苯二酚0.5 mg的貯備液。精密量取該液1.0、2.5、5.0、10、20 mL，分別置于50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混勻。每份進樣3次，在上述色譜條件下分析。以峰面積（Y）與其對應的質量濃度（X）進行回歸分析，得回歸方程：Y＝18650X－3213.6（r＝0.9999），即間苯二酚檢測濃度線性范圍為10～200 μg·mL－1。

（2）苯酚：精密稱取苯酚標準品100 mg，置于100 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含苯酚1 mg的貯備液。精密量取該液1.0、2.5、5.0、10、20 mL，分別置于100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混勻。每份進樣3次，在上述色譜條件下分析。以峰面積（Y）與質量濃度（X）進行回歸分析，得回歸方程：Y＝19863X－16178（r＝0.9999），即苯酚的檢測濃度線性范圍為10～200μg·mL－1。

2.4 重復性試驗

取同一批號（100402）樣品6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定。結果，間苯二酚標示量為100.1%（RSD＝0.78%）、苯酚標示量為101.0%（RSD＝0.56%）。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.4”項下的溶液在室溫放置1、2、3、4、5、6 h時測定峰面積，計算RSD。結果，間苯二酚平均峰面積1712468，RSD＝0.31%（n＝6），苯酚平均峰面積852097，RSD＝0.45%（n＝6），表明供試品溶液在6 h內穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗

采用加樣回收率試驗方法。精密量取已知含量的樣品（間苯二酚0.1 mg·mL－1、苯酚0.0375 mg·mL－1）2.5 mL，各6份，置于50 mL容量瓶中，分別精密加入“2.3”項下間苯二酚貯備液2.5、5.0、10 mL和苯酚貯備液1.25、2.5、5 mL，用流動相稀釋至刻度，搖勻，測定峰面積。回收率試驗結果見表2。

表2 回收率試驗結果Tab 2 Results of recovery tests

2.7 樣品含量測定

取樣品3批，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液及“2.2.2”項下的混合標準品溶液各20μL，進樣測定，用外標法計算含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

在200～400 nm波長范圍內對間苯二酚、苯酚標準品進行紫外光譜掃描，結果，間苯二酚在274 nm波長處具有最大吸收峰，苯酚在270 nm波長處具有最大吸收峰，兩者最大吸收波長相差4 nm，絕大部分吸收光譜都重疊在一起，相互干擾無法進行定量分析。因此，本文采用RP-HPLC法，選擇甲醇-水系統(tǒng)作為流動相，并考察了該系統(tǒng)中甲醇不同加入量對間苯二酚和苯酚保留時間和色譜分離的影響。結果顯示，甲醇比例增大，被測組分保留時間隨之縮短。為保證間苯二酚和苯酚完全分離，同時又盡量縮短一次進樣的分析時間，達到同時測定的目的，最后確定流動相最佳配比為甲醇-水（65∶35）。

由于本制劑中的主藥成分間苯二酚、苯酚在光照條件下不穩(wěn)定，易氧化成醌類而影響測定，故該制劑的含量測定應在避光條件下進行，比如用黑紙包裹容量瓶測定，這樣待測溶液穩(wěn)定性會更好。

[1]熊國營.二階導數(shù)紫外光譜法測定復方間苯二酚洗劑中苯酚及間苯二酚的含量[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2008，11（6）：1333.

[2]張 群，占 峰，開小明.雙波長線性回歸光度法同時測定苯酚和間苯二酚[J].光譜學與光譜分析，2006，26（11）：2110.

[3]洪慧豐，李安華.系數(shù)倍率法測定復方間苯二酚涂劑中二組分的含量[J].中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2003，20（1）：63.

[4]衛(wèi)生部藥政局.中國醫(yī)院制劑規(guī)范[S].第2版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1995：100.