干燥綜合征模型小鼠涎腺AQP1、AQP5表達(dá)的研究

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴陽(yáng)550003)

干燥綜合征(SS)是一種侵犯涎腺、淚腺等外分泌腺為主的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制仍不清楚，近年來(lái)國(guó)外研究顯示水分子通道蛋白(AQP)可能與SS發(fā)病有關(guān)［1］。AQP1和 AQP5在涎腺、淚腺組織中高表達(dá)，與SS涎腺、淚腺損傷及唾液、淚液量的分泌密切相關(guān)。2009年9月～2010年3月，我們根據(jù)文獻(xiàn)建立 SS 模型小鼠［2，3］，檢測(cè)其 AQP1 和 AQP5的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇BALB/C小鼠40只，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量20 g左右。購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 百白破疫苗購(gòu)自北京天壇生物制品股份有限公司;弗氏完全佐劑(Sigma，USA);考馬斯亮蘭試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;TRIzol(Invitrgen，USA);RT-PCR試劑盒購(gòu)自凱基生物。引物購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，AQP1上游引物 CTGGCCTTTGGTTTGAGCAT，下游引物 CCACACACTGGGCGATGAT，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149 bp;AQP5上游引物GCGCTCAGCAACAACACAAC，下游引物 GTGTGACCGACAAGCCAATG，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149 bp。

1.3 動(dòng)物模型的建立 將BALB/C小鼠隨機(jī)分成模型組和空白組，每組15只。取10只同種小鼠，無(wú)菌條件下取頜下腺，勻漿后，測(cè)定抗原濃度2 171 μg/ml，加 PBS 緩沖液稀釋到 1 000 μg/ml，加入同體積弗氏完全佐劑，最后濃度為500μg/ml，每只小鼠背部多點(diǎn)注射抗原，總量為1ml/只。同時(shí)背部注射百白破疫苗0.5 ml，產(chǎn)生類(lèi)似于人類(lèi)SS的唾液腺改變及臨床表現(xiàn)特點(diǎn)。

1.4 觀察方法 于造模后每周觀察SS小鼠體質(zhì)量、攝食量、飲水量和唾液腺分泌功能的測(cè)定。4周后(每組隨機(jī)抽取10只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象)用濕重法測(cè)量唾液流率，記錄1周的總飲水量后殺鼠，取出涎腺標(biāo)本，HE染色后病理檢測(cè)，光鏡下觀察淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組化 SP法測(cè)定 AQP1、AQP5的表達(dá)［4］。提取總 RNA，RT-PCR對(duì) AQP1、AQP5的 mRNA進(jìn)行定量分析，AQP1、AQP5 mRNA的表達(dá)以它們與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度比值表示每份標(biāo)本的相對(duì)mRNA水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 病理觀察 空白組小鼠頜下腺組織腺泡大小均勻，腔內(nèi)充滿(mǎn)分泌液，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)管排列整齊，無(wú)擴(kuò)張。模型組細(xì)胞間隙擴(kuò)大，間質(zhì)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡大小不等，腺體萎縮，有毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，并可見(jiàn)少量纖維組織。

2.2 免疫組化結(jié)果 空白組小鼠頜下腺AQP1和AQP5均見(jiàn)較多腺泡的頂膜、側(cè)膜、基膜和分泌管、導(dǎo)管上皮內(nèi)均有較強(qiáng)染色的棕黃色顆粒。模型組AQP1亦見(jiàn)棕黃色顆粒，但染色較空白組淺，兩者相比較差異不大，而AQP5在模型組腺泡、分泌管、導(dǎo)管等處染色減弱或消失。

2.3 AQP1 mRNA、AQP5 mRNA的表達(dá) 見(jiàn)表1。

表1 兩組AQP1 mRNA、AQP5 mRNA的表達(dá)比較(±s)

表1 兩組AQP1 mRNA、AQP5 mRNA的表達(dá)比較(±s)

注:與空白組比較，*P ＜0.01

?

3 討論

SS患者在靜息和刺激狀態(tài)下唾液流率均降低，可以導(dǎo)致言語(yǔ)困難、進(jìn)食障礙、口腔念珠菌病、猖齲齒和慢性涎腺炎等一系列病變。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為是由于SS患者涎腺組織中促炎因子，如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致腺體組織的破壞［5］。目前較多的研究認(rèn)為SS腺泡細(xì)胞內(nèi)的液體分泌與電解質(zhì)的活躍轉(zhuǎn)運(yùn)及水分子的流動(dòng)之間的滲透性偶聯(lián)相關(guān)［6］，而AQP在此過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。

在已知的AQP家族中，分布于哺乳動(dòng)物涎腺的有 AQP1、AQP2、AQP3、AQP4 和 AQP8［1］，其中 AQP1和AQP5在涎腺組織中高表達(dá)與唾液量的分泌密切相關(guān)，在某些涎腺疾病如SS及其病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［7］。但只有AQP5在涎腺分泌細(xì)胞中的分布被接受，AQP5最初是從大鼠頜下腺的cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出來(lái)的，敲除AQP5基因的小鼠所表現(xiàn)出來(lái)的低水平的唾液分泌速度和低分泌量的高滲性唾液均支持AQP5在涎腺功能的正常運(yùn)作中具有其特定的生理作用［8］。對(duì)AQP在人涎腺中的作用還了解的很少，AQP1在肌上皮細(xì)胞表面的表達(dá)也許可以解釋肌上皮細(xì)胞及其突起所構(gòu)成的緊密包圍著腺泡的籃形結(jié)構(gòu)并沒(méi)有成為水流通過(guò)的顯著障礙的現(xiàn)象［9］。

SS動(dòng)物模型的研究目前主要局限于鼠類(lèi)，尚無(wú)大型動(dòng)物的研究報(bào)道。Dean等最初應(yīng)用Wistar大鼠頜下腺和舌下腺勻漿加完全弗氏佐劑及百日咳桿菌免疫LEW大鼠，成功誘導(dǎo)了免疫性涎腺炎的發(fā)生，并檢測(cè)到抗涎腺和抗淚腺導(dǎo)管上皮抗體，之后的許多研究在多種不同品系的鼠種均成功誘導(dǎo)了SS的發(fā)生［10］。誘導(dǎo)型SS的動(dòng)物模型主要在腺體的局部模擬了人類(lèi)SS的表現(xiàn)，為SS發(fā)病機(jī)制的研究及治療提供了實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SS模型小鼠頜下腺AQP1表達(dá)與空白組無(wú)明顯差異，表明此造模方法用于AQP1的觀察效果不好。而SS模型小鼠頜下腺中AQP5表達(dá)有非常顯著的改變，較空白組明顯下降，說(shuō)明誘導(dǎo)型SS造模方法用于觀察AQP5的變化是可行的。

［1］李菁，趙巖，唐福林.水分子通道蛋白在干燥綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2004，8(2):105-107.

［2］肖林，楊軍，暨興華，等.干燥綜合征動(dòng)物模型的建立［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2003，32(3):306-309.

［3］楊軍，楊彥春.腺病毒介導(dǎo)AQP1基因治療涎腺干燥綜合征的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2005，34(3):323-325.

［4］Kim SW，Lee JU，Nah MY，et al.Cisplatin decreases the abundance of aquaporin water channels in rat kidney［J］.J Am Soc Nephrol，2001，12(5):875-882.

［5］王云，王禮文.免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的致病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22(4):370-373.

［6］楊寶學(xué)，趙雪儉.水通道蛋白研究進(jìn)展［J］.中國(guó)病理生理雜志，2005，21(8):1619-1622.

［7］Rehman HU.Sjogren’s syndrome［J］.Yonsei Med J，2003，44(6):947-954.

［8］Steinfeld S，Cogan E，King LS，et al.Abnormal distribution of aqparin-5 water channel protein in salivary in glands from Sjogren’s syndrome patients［J］.Lab Invest，2001，81(2):143-148.

［9］Gresz V，Kwon TH，Hurley PT，etal.Identification and localization of aquaporin water channels in human salivary glands［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，281(1):G247-254.

［10］陳海英，栗占國(guó).干燥綜合征動(dòng)物模型的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2004，8(8):493-496.