低強度超聲對放射線損傷的犬下頜骨微血管修復作用的實驗研究*

陳 磊 吳高義 王昭領 朱國雄

下頜骨放射性骨壞死(Osteoradionecrosis of Mandible ORNM)是頭頸部惡性腫瘤放療后嚴重的并發(fā)癥，主要病理表現為放療后頜面部軟、硬組織處于低氧、少血管狀態(tài)，頜骨內動脈發(fā)生炎癥反應，內膜腫脹，骨髓及骨膜血管栓塞及纖維化，引起局部血供和營養(yǎng)障礙。現在觀點認為ORNM是血管和Naversa骨系統放射后的晚期并發(fā)癥[1]。放療可導致組織血供變差、細胞活力下降、膠原蛋白減少。因此，如何促進放療后骨組織內血管的修復，對于治療ORNM具有重要意義。近年來研究發(fā)現[2]，低強度超聲波可以促進血管的發(fā)生，改善局部血液循環(huán)，但運用低強度超聲波治療ORNM，尚無相關研究報道。因此，本研究通過觀察低強度超聲對下頜骨內微血管的作用，探討運用低強度超聲波治療ORNM的可能機制。

1.材料與方法

1.1 材料 放射源采用Varian 600C/D電子加速器 (Varian Inc.Corporate， USA)； Leica DMLA全自動顯微鏡(Leica公司，德國)，US10超聲治療儀(興萬電子儀器，香港)；健康成年雜種犬30只，雌雄不限，年齡2-3周齡，體重10-17kg，(由山東大學實驗動物中心提供)，普通飼料喂養(yǎng)(山東大學實驗動物中心提供)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立 將犬隨機分為實驗Ⅰ組、實驗Ⅱ組和對照組，每組10只。2.5%戊巴比妥鈉30mg/kg犬小腿大隱靜脈注射麻醉。電子直線加速器行分次次照射。照射方法：總劑量60 Gy，分4次照射，每次15Gy，每2次之間間隔一周，對照組不行放射線照射。照射結束后1個月，無菌條件下拔除實驗動物雙側下頜第一磨牙。繼續(xù)飼養(yǎng)動物。

1.2.2 CD34免疫熒光染色 分別在放射線照射后1個月，2個月，4個月，3%戊巴比妥鈉30mg/kg行隱靜脈注射麻醉，取各實驗組下頜骨磨牙區(qū)骨塊。4%多聚甲醛溶液固定2天，脫鈣，按常規(guī)組織免疫方法制成連續(xù)石蠟切片，片厚5μm，切片經常規(guī)烤片，免疫組化SABC法抗CD34抗體(博奧森生物技術有限公司北京)免疫熒光染色，二抗用熒光素標記大鼠抗犬IgG(博奧森生物技術有限公司北京)，熒光顯微鏡下進行觀察微血管的變化，光鏡下進行觀察。熒光顯微鏡下CD34以血管內皮細胞胞質呈棕紅色為陽性表達。

1.2.3 超聲治療和微血管密度(MVD)檢測 對放射線照射4個月后的實驗Ⅰ組動物行超聲治療，治療部位為雙側下頜第一磨牙區(qū)，方法為超聲強度30mW/cm2，頻率 1.5 MHz，脈沖寬度 200μs和重復頻率1kHz的脈沖波[3]，每天使用1次，每次20min，治療時間30d，實驗Ⅱ組作為陰性對照不做超聲治療。

分別于超聲治療10d，20d，30d取材，下頜骨于20%多聚甲醛溶液固定2天。取部分脫鈣，石蠟包埋，按常規(guī)組織免疫方法制成連續(xù)石蠟切片，片厚5μm，切片經常規(guī)烤片，免疫組化SABC法抗CD105(博奧森生物技術有限公司北京)抗體染色，蘇木素復染，中性樹膠封片，光鏡下進行觀察。CD105以血管內皮細胞胞質呈棕褐色為陽性表達，對免疫組化染色切片進行圖像采集，切片在40倍光鏡下挑選微血管分布最高區(qū)域，在200倍視野下計數5個視野的被染成棕褐色的血管數目，取其平均值作為MVD，每一個與鄰近的微血管明顯分離的染成棕褐色的血管內皮細胞或血管內皮細胞簇都視為獨立的微血管并進行圖像分析。

1.3 統計學分析：所有數據均采取均數±標準差表示，兩組間數據間比較用成組設計資料的t檢驗，有關指標采用SPPS13.0統計軟件做相關分析。

2.結果

2.1 體表結果 在照射1周后，實驗組犬均出現進食困難、流口水、口腔內粘膜潰爛等癥狀，1個月后，實驗Ⅰ組、實驗Ⅱ組犬的下頜開始脫毛，4個月后牙槽骨外露,主要位于拔牙區(qū)(圖1)。X線片上顯示局部骨小梁增粗，骨紋理模糊，出現不規(guī)則的結構紊亂區(qū)，且密度不均勻

2.2 CD34免疫熒光結果 對照組CD34呈紅色熒光強陽性表達，實驗Ⅰ組呈陽性表達；實驗Ⅱ組呈弱陽性表達(圖2-6)。

2.3 微血管密度(MVD)檢測結果 實驗Ⅰ組的微血管密度為：10d組(4.04±0.77)，20d組(6.22±0.65)，30d 組(7.13±0.43)；、實驗Ⅱ組的微血管密度為(3.85±0.89)；對照組的微血管密度為(7.41±0.45)。統計結果顯示各組之間的差異具有顯著性的意義(P＜0.05)(表1)。

表1 各組不同時間點血管密度(n=5,)

表1 各組不同時間點血管密度(n=5,)

3.討論

3.1 建立下了頜骨放射性損傷的動物模型 上世紀初，人們就已經認識到放射線能引起骨組織的損害，但通過動物實驗來研究其損害是由Chambers等在1958年用狗開始的[4]。后來，不少學者相應采用大鼠、兔、狗等動物來做實驗研究[5,6]。但由于鼠、兔類動物體積小、生命力弱等原因一直未能建立理想的動物模型。對于放療的劑量，普遍的觀點是，骨組織的放射耐受劑量為60Gy左右，當放療超過60Gy時，骨修復損傷的能力受到較大損害。而整塊骨的大部分照射劑量小于60Gy時，骨組織尚處于其耐受劑量范圍，具有一定修復能力[7]。

因此，在本實驗采用的總照射劑量為60Gy。放射線照射3個月后，我們通過X線片發(fā)現犬的下頜骨均出現骨小梁增粗，骨紋理模糊等ORNM的早期癥狀。在對血管內皮標記抗體CD34的檢測后發(fā)現，隨著時間的延長，犬下頜骨的CD34抗體陽性表達越來越弱，表明骨損傷的程度越來越嚴重，這也很好的模擬ORNM發(fā)生過程。說明直線加速器行多次照射總劑量60Gy完全可以作為犬ORNM模型的照射劑量。雖然更大的照射劑量雖然也可能發(fā)生ORNM，但有可能會引起動物死亡，影響實驗的繼續(xù)進行。且60Gy已經能夠較好模擬人的放療劑量。因此，我們認為，本實驗所采用的多次照射總劑量60Gy為犬ORNM動物模型較為理想的照射劑量。

3.2 低強度超聲能夠促進犬下頜骨微血管的生成 目前的血管內皮標記抗體主要有：CD34，CD31，CD105(endoglin)等，有人認為CD34在微血管中表達最強，也有人認為CD31對微血管內皮細胞敏感性較強。但CD105(endoglin)對增殖狀態(tài)的血管內皮細胞有高度敏感性是大家所公認的[8,9]，而其對于成熟的血管內皮細胞卻無特異性，因而在目前還缺乏直接檢測血管豐富程度的情況下，可用CD105標記血管內皮細胞，檢測骨內血管的增值程度已成為對血管生成定量分析的金指標。本實驗實驗結果表明，采用30mW/cm2強度的1MHz 1∶4脈沖超聲波作為實驗組處理因素，超聲治療10d，20d，30 d，MVD逐漸增加，說明低強度超聲能夠促進了骨組織的微血管生成，并可能以此促進犬下頜骨血供。

3.3 低強度超聲促進犬下頜骨微血管修復的機理 高能射線粒子對血管、骨等組織損傷，是通過細胞內水分子轉變?yōu)樽杂苫鏗+、OH+；與DNA、RNA或酶分子作用，破壞分解氨基酸或核酸序列。在細胞水平上，表現為染色體斷裂、交聯和分解，使細胞損傷或死亡。在組織水平上，則表現為血栓形成[10]，內皮壞死和玻璃樣變性。因此，修復放射線損傷骨組織，促進血液循環(huán)非常重要。

低強度超聲可以穿透組織，其產生的振蕩力作用于組織中包括細胞內和細胞外的各種液體及胞膜成分。振蕩的生理效應可以分為致熱效應和非致熱效應。致熱效應能增加血運，增加膠原延展性，減輕疼痛和肌肉痙攣[11]，超聲還能使無功能性毛細血供，從而使各類細胞因子及促進骨愈合的必要成分的運輸增強，促進了營養(yǎng)物質轉運和代謝廢物排除[12]。

低強度超聲可以增加肥大細胞脫顆粒，增加白細胞對血管內皮細胞的粘附，刺激成纖維細胞產生膠原，增加吞噬性成纖維細胞和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)的釋放，實驗表明超聲可以刺激人下頜骨細胞、牙齦成纖維細胞和外周血單核細胞產生多種促進血管發(fā)生的細胞因子，包括IL-8、bFGF和VEGF等[13]。進而促進新生血管形成[14]，增加血流。超聲可以誘導骨髓基質細胞表面粘附分子的表達(P-selectin and ICAM-1)，使移植入肌肉內的骨髓基質細胞誘導周圍血管發(fā)生[15]。

4.小結

低強度超聲對放射線損傷的下頜骨微血管修復作用更主要是通過促進血管發(fā)生來間接促進骨的愈合。超聲促進創(chuàng)傷、慢性潰瘍愈合，促進骨折等作用都與其增強血管生成的作用密切相關。最佳時機多在固定期早期。但究竟低強度超聲具體作用的靶細胞是什么，其作用的詳細機制以及信號傳導途徑還有待進一步闡明。

[1]Wikstrom P,Lissbrant IF,Stattin P,et al.Endoglin(CD105)is expressed on immature blood vessels and is a marker for survival in prostate cancer[J].Prostate,2002,51(4)：268-275

[2]Lau WY,Chow CK.Radiation-induced petrous internal carotid artery aneurysm[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,2005,114(12)：9399-9940

[3]Tanzer M,Kantor S,Bobyn TD.Enhance ment of bone growth into porousint ramedullary implants using non-invasive low intensity ultrasound[J].J Orthop Res,2001,19(2)：195-199

[4]解雪濤,邱蔚六,袁文化等.豚鼠下頜骨血管系統放射損傷的實驗研究[J].華西口腔醫(yī)學雜志,1998,16(1)：5-7

[5]Rayatt SS,MureauMA,Hofer SO.Osteoradionecrosis of the mandible：Etiology,p revention,diagnosis and treatment[J].Indian J Plast Surg,2007,40(supp lement)65-71

[6]BrennerDJ.The linear-quadraticmodel is an app rop riatemethodology for determining isoeffective doses at large dosesper fraction[J].SeminradiatOncol,2008,18(4)：234-239

[7]蔡以理，王中和，胡海生，等.頭頸癌患者牙槽骨放療劑量的定量研究[J].中國口腔頜面外科雜志,2004,2(4)：257-260

[8]Perrier M,Moeller P.Osteoradionecrosis：a review of the literature [J].Schweiz Monatsschr Zahnmed,1994,104：271-277

[9]CuriMM,Dib LL,,Osteoradionecrosisofthejaws：a retrospective study of the background factors and treatment in 104 cases[J].J Oral Maxillofac Surg,1997,55：540-544

[10]Lau WY,Chow CK.Radiation-induced petrous internal carotid artery aneurysm[J].Ann Otol Rhinol Laryngol[J].2005,114(12)：939-940

[11]Yang KH,Parvizi J,Wang SJ,et al.Exposure to low intensity ultrasound increase aggrecan gene expression in a rat femur fracture mode[J].J Orthop Res,1996,14(7)：802

[12]Store G,Eribe ERK,Olsen I.DNA-DNA hybridization demonstrates multiple bacteria in osteoradionecrosis[J].Int J Maxillofac Surg,2005,34：193-196

[13]Bras J,de Jonge HK,van Merkesteyn JP.Osteoradionecrosis of mandibular：pathogenesis[J].AmJ Otolaryngol,1990,11：244-250

[14]范紅渠,周衛(wèi)兵,郝魯峰,等.bFGF對異種脫鈣骨愈合過程中成骨細胞VEGF表達的影響[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志,2007,5(1)：16-19

[15]Fritton SP,Mc Leod KL,Rubin CT.Quantifying the strain history bone：spatial uniformity and self-similarity of low magnitude strains[J].J Biomech,2000,33：317-325