Caspase信號轉導通路在高糖引發牙周膜細胞凋亡中的作用*

劉加強 劉洪臣 馮 元 高 輝

Caspase家族是近幾年研究的熱點之一，屬于ICE/CED3蛋白酶家族成員，現已發現至少有14種。該家族與細胞凋亡密切相關，它是通過級聯放大反應，最終激活核酸內切酶來實現介導細胞凋亡的[1]。在眾多的Caspase家族成員中，Caspase-3處于凋亡環節的核心部位，對整個細胞凋亡過程起著決定性作用[2]，因此，本實驗目的在于探討Caspase-3在高糖環境下引起的體外人牙周膜細胞凋亡過程中的作用。本實驗分別采用葡萄糖濃度為5.5mmol/L，15mmol/L，25mmol/L，35mmol/L的DMEM培養基培養人牙周膜細胞，時間為24小時，并采用Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk為對照，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，Western-blot法檢測Caspase-3蛋白酶原(procaspase-3)和裂解后有活性的蛋白酶(cleaved Caspase-3)變化情況，明確Caspase細胞凋亡通路在此過程中的作用。

1.材料與方法

1.1 材料

z-DEVD-fmk(Santa cruz)，β-actin 兔多克隆抗體(Santa cruz)，蛋白質分子量Marker(天根生化科技有限公司，北京)，顯影液定影液(尚柏生物PCP010，北京)，DYCP-31D型水平式電泳槽(賓達英創科技有限公司，北京)，DYY-7C型電泳儀(六一儀器廠，北京)，溫控超速離心機(Eppendorf，Germany)，轉膜儀(J-MAX)。

1.2 方法

本實驗采用組織塊法、酶消化法和蓋玻片固定相結合進行人牙周膜細胞的原代培養。取因正畸治療拔除的的健康前磨牙4顆，用含有1000單位/升青霉素和鏈霉素的0.01mol/L PBS反復沖洗后，無菌條件下，用銳利的刀片刮取根中1/3區域的牙周膜組織，0.3%Ⅰ型膠原酶5毫升消化30min，1500轉/分離心5min，棄上清液，沉淀物用2毫升含20%胎牛血清的DMEM培養基重懸洗滌，1200轉/分離心5 min，棄上清液，沉淀物平鋪于6孔培養板中，用洗凈并消毒的蓋玻片壓緊，防止加入培養液時組織塊浮起，加入1.5毫升含20%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下于恒溫孵箱中靜置培養。

1.2.1 實驗分組

本實驗共分五組，每組3個樣本：

第一組：葡萄糖濃度為5.5mmol/L

第二組：葡萄糖濃度為15mmol/L

第三組：葡萄糖濃度為25mmol/L

第四組：葡萄糖濃度為35mmol/L

第五組：葡萄糖濃度為35mmol/L，該組中加入Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk，濃度為2μmol/L。采用流式細胞儀定量檢測每組細胞凋亡情況，Western-blot法檢測Caspase-3蛋白酶原(procaspase-3)和裂解后有活性的蛋白酶(cleaved Caspase-3)變化情況。

1.2.2 實驗數據統計學處理

運用SPSS13.0軟件包，對所得結果進行單因素方差分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2.結果

細胞培養的最初3d，倒置顯微鏡下未見有成纖維樣細胞爬出，隨著培養時間延長，在接種后7－10d左右可見組織塊周圍有少量細胞長出，貼壁生長，以組織塊為中心，呈放射狀排列。15d左右細胞彼此接觸融合成片，大約達到24孔板底面的80%，個別部位有細胞重疊現象，此時應進行傳代。5～8代的細胞形態一致，性質穩定，立體感強，生長狀況良好，適合進行有關的研究實驗。

2.1 流式細胞儀結果

流式細胞儀定量分析各組凋亡細胞百分比，每組三個樣本：

第一組：葡萄糖濃度為5.5mmol/L，24小時2.6%，3.4%，3.1%

第二組：葡萄糖濃度為15mmol/L，24小時3.7%，4.1%，2.6%

第三組：葡萄糖濃度為25mmol/L，24小時4.4%，5.2%，5.6%

第四組：葡萄糖濃度為35mmol/L，24小時6.3%，7.5%，7.6%

第五組：糖35mmol/L+z-DEVD-fmk，24小時 4.1%，5.7%，5.3%

每組均值及方差及凋亡情況對比情況見圖1，2。

圖1 各組細胞凋亡百分比與5.5mmol/L比較：**P＜0.01

從表中可以看出，總體趨勢是隨著葡萄糖濃度的增高，牙周膜細胞凋亡比例升高，但總的細胞凋亡比例均小于10%，說明各組凋亡的細胞只占到很小一部分，大部分細胞沒有發生凋亡。

圖2 各組細胞凋亡百分比與5.5mmol/L比較：**P＜0.01；與35mmol/L+DEVD組比較：##P＜0.01

從表中可以看出，Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk可以顯著抑制高糖引發的牙周膜細胞凋亡，說明Caspase-3細胞凋亡途徑參與了這一過程。但z-DEVD-fmk不能夠完全抑制高糖引發的牙周膜細胞凋亡，說明除了Caspase-3細胞凋亡途徑外，還有其他途徑參與了這一過程。

2.2 Caspase-3蛋白表達結果

Western-blot法測定每組 Caspase-3酶原(pro-caspase-3)和 活 性 Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白含量，電泳后采用軟件分析各組染色條帶灰度值，實驗重復三次后用SPSS13.0軟件進行統計學分析，結果見圖3。

圖3 pro-caspase-3以及cleaved Caspase-3蛋白含量變化情況與5.5mmol/L比較：*P＜0.05，**P＜0.01

從表中可以看出，隨著糖濃度的增加，cleaved Caspase-3含量逐漸增加，說明細胞凋亡活動逐漸增強，但pro-caspase-3濃度沒有變化，說明發生凋亡的細胞只占了很小一部分比例，大部分細胞沒有發生凋亡，這點與流式細胞儀結果相一致。大量正常活細胞內的pro-caspase-3含量掩蓋了小部分凋亡細胞內因活化而減少的pro-caspase-3，因此檢測不出變化。而cleaved Caspase-3在正常細胞內沒有或是含量甚微，因此少量的變化即可被檢測出來。加入Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk后cleaved Caspase-3的含量與35mM組比較沒有變化，說明z-DEVD-fmk并不能抑制procaspase-3被活化成cleaved Caspase-3，只能抑制cleaved Caspase-3的活性。

3.討論

Caspase即半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶，是一組具有相似的氨基酸序列和二級結構的半胱氨酸蛋白酶，不但與真核細胞凋亡密切相關，還參與多種細胞因子的成熟、細胞生長以及分化[3-6]。Caspase的底物種類較多，但主要對象是DNA修復調節因子、細胞骨架、RNA剪接以及細胞周期中的某些成員，而不是廣泛地降解多種蛋白質。Caspase抑制劑可分為人工合成的酶抑制劑、天然的酶抑制劑與拮抗Caspase酶作用的三類。人工合成的抑制劑主要作用部位是Caspase活性中心，分為肽類和非肽類抑制劑，其中肽類抑制劑因為特異性高，易于合成，成本較低，因而被廣泛應用，如z-DEVD-fmk，Ac-DEVD-CHO等。

根據預實驗及參考文獻[7,8]，我們選擇葡萄糖濃度為5.5mmol/L，15mmol/L，25mmol/L，35mmol/L的DMEM培養基培養人牙周膜細胞，高糖作用時間為24小時，因人體內正常血糖濃度大約為5.5mmol/L，因此本實驗中葡萄糖濃度為5.5mmol/L的實驗組可看作是生理對照組。z-DEVD-fmk作為實驗室常用的Caspase-3特異性抑制劑已被廣泛應用，因此本實驗選擇z-DEVD-fmk作為抑制劑對照，終濃度為2μmol/L，在加入葡萄糖前2小時加入[9]，以明確Caspase通路在此過程中的作用。

從本實驗流式細胞儀結果中可以看出，隨著糖濃度的增高，牙周膜細胞凋亡比例也隨之增加，說明高糖可以引發人牙周膜細胞的凋亡，與以往文獻報道相一致[10,11]，但凋亡比例都不高，都在10%以下，與體內實際情況相一致，加入Caspase-3抑制劑z-DEVD-fmk后，細胞凋亡比例明顯低于未加入組，說明z-DEVD-fmk可以抑制高糖引起的牙周膜細胞凋亡，這進一步證實了高糖引起的牙周膜細胞凋亡是由Caspase-3介導的。此外，z-DEVD-fmk組細胞凋亡比例明顯高于生理糖濃度組，這說明z-DEVD-fmk不能完全阻斷高糖引起的牙周膜細胞凋亡，這種情況有兩種可能，第一，z-DEVD-fmk并不能完全抑制Caspase-3功能，只降低其活性，Caspase-3仍然可以發揮部分介導細胞凋亡的作用。因此就會出現加入z-DEVD-fmk后的高糖組細胞凋亡百分比低于不加入z-DEVD-fmk的高糖組，但卻高于生理糖濃度組。第二，z-DEVD-fmk可以完全抑制Caspase-3功能，但這一凋亡過程并不是完全是由Caspase-3介導的，還存在其他調控途徑，因此加入z-DEVD-fmk后只能抑制Caspase-3介導的這部分細胞凋亡，卻并不能抑制其他途徑介導的細胞凋亡，因此也會出現上述的結果。但具體是哪種機制還需證實。對Caspase-3的檢測結果可以看出，隨著糖濃度的增加，雖然未裂解的無活性的酶原pro-caspase-3濃度沒有變化，但有裂解后有活性的cleaved Caspase-3含量逐漸增加，說明細胞凋亡活動逐漸增強，但發生凋亡的細胞只占了總量的很小一部分比例，大部分細胞沒有發生凋亡現象，這點與體內實際情況和流式細胞儀結果相一致。大量正常活細胞內的pro-caspase-3含量掩蓋了小部分凋亡細胞內因活化而減少的pro-caspase-3，而且即使在少部分發生凋亡的細胞內，也不是所有的pro-caspase-3酶原均發生了裂解活化，因此檢測不出變化。而cleaved Caspase-3在正常活細胞內沒有或是含量甚微，因此少量的變化即可被檢測出來。加入Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk后cleaved Caspase-3的含量與35mM組比較沒有變化，說明z-DEVD-fmk并不能抑制pro-caspase-3被活化成cleaved Caspase-3，只能抑制cleaved Caspase-3的活性。

[1]Dotto GP,silke J.More than cell death：caspases and caspase inhibitors on the move[J].Dev Cell.2004 Jul，7(1)：2-3

[2]劉加強,劉洪臣.細胞凋亡及其在牙周領域中的研究進展[J].中華老年口腔醫學雜志，2010，8(2)：110-113

[3]Paul Tawa,Andre Giroux,Erich Grimm,et al.Correlating the fractional inhibition of caspase-3 in NT2 cells with apoptotic markers using an active-caspase-3 enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytical Biochemistry， 2006，350(1)：32-40

[4]Mami Yamamoto,Yayoi Kamata,Toshii Iida,etal.Quantification of activated and total caspase-14 with newly developed ELISA systems in normal and atopic skin[J].Journal of Dermatological Science，2011，61(2)：110-117

[5]Noriyuki Miyoshi，Kisa Naniwa,Takeshi Kumagai,et al.α-Tocopherol-mediated caspase-3 up-regulation enhances susceptibility to apoptotic stimuli[J].Biochemical and Biophysical Research Communications， 2005， 334(2)：466-473

[6]Maryla Krajewska,Robert E.Rosenthal,Jowita Mikolajczyk,et al.Early processing of Bid and caspase-6,-8,-10,-14 in the canine brain during cardiac arrest and resuscitation[J].Experimental Neurology， 2004， 189(2)：261-279

[7]Kumiko Kaifu1,Hideyasu Kiyomoto1,Hirofumi Hitomi1,et al.Insulin attenuates apoptosis induced by high glucose via the PI3-kinase/Akt pathway in rat peritoneal mesothelial cells[J].Nephrol Dial Transplant， 2009， 24：809-815

[8]Takata H,Ikeda Y,Suehiro T,et al.High glucose induces transactivation of the alpha2-HS glycoprotein gene through the ERK1/2 signaling pathway[J].J Atheroscler Thromb，2009，16(4)： 448-456

[9]S，eref Barut,Yusuf Atilla U¨nlü,Alper Karaogˇlan,et al.The neuroprotective effects of z-DEVD.fmk,a caspase-3 inhibitor,on traumatic spinal cord injury in rats[J].Surgical Neurology，2005，64(3)： 213-220

[10]Ali.M.Sharifi,Habib Eslami,Bagher Larijani,et al.Involvement of caspase-8, -9, and -3 in high glucose-induced apoptosis in PC12 cells[J].Neuroscience Letters，2009，459(2,7)：47-51

[11]David A.Allen,Muhammad M.Yaqoob,Steven M.Harwood.Mechanisms of high glucose-induced apoptosis and its relationship to diabetic complications[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16(12)：705-713