情緒應激后大鼠顳下頜組織學及關節盤內P物質的相關變化*

吳高義 陳 磊 司武俊 王昭領 朱國雄

顳下頜關節病(temporomandibular disorders，TMD)病因復雜，與咬合、情緒等因素密切相關[1]。但因建模困難，指標不易量化等原因，情緒因素與TMD的相關研究鮮有報道。近年來研究發現，感覺神經通過其末梢釋放神經肽類物質，與關節軟骨的代謝有密切的關系[2,3]，其中P物質(substance P，SP)廣泛分布于TMJ中，在實驗誘導下的TMJ病變的發生、發展中起重要作用[4]。因此，本實驗運用交流箱動物模型，通過觀察情緒應激后的大鼠TMJ內SP的表達情況，進一步了解情緒應激與TMD關系。

1.材料及方法

1.1 材料 SD大鼠，三級，90只，體重120 g±20g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供編號SCXK(軍)2002-005，雌雄對半。

實驗用大鼠交流箱(由第四軍醫大學教保中心制)，電刺激發生儀(由第四軍醫大學物理教研室提供，直流電刺激電壓48伏，刺激頻率0.5赫茲)，SP抗體(Sigma公司，美國)，SABC試劑盒和DAB試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)。

1.2 實驗動物分組 研究工具與測評方法見前文[5]。隨機將90只大鼠分為3組，每組各30只，分別為對照組，情緒應激組(PS)和足部電擊組(FS)，各組動物的體重、性別通過均衡檢驗，證實無差異，具有可比性，動物模型的制備和飼養條件相同。

施加刺激因素方法如下：實驗開始前一周，將大鼠都放入相應的交流箱中適應，不給任何刺激，使其適應環境。實驗開始后，每天上午固定時間給與FS組電擊，每日30min，電壓48伏，應激頻率0.5赫茲(圖1)，常規飼料喂養。

各組動物實驗方法如下：(1)空白對照組：以無應激狀態下飼養大鼠；(2)FS組：每天上午固定時間給與電擊，每日30min，電壓48伏，應激頻率0.5赫茲；本組大鼠僅作為應激原，不作為實驗觀察對象。(3)PS組：通過FS組的排謝物，豎毛，尖叫等反應受到心理影響。

圖1 情感交流箱示意圖

1.3 實驗方法 對照組、PS組動物分別在1周、3周及5周時隨機選取10只取材，取材時用l0g/L戊巴比妥鈉(30mg／kg)腹腔內注射麻醉，經左心室插管，先用10mL/L肝素生理鹽水沖洗血液，再用40g/L多聚甲醛灌流固定，取雙側TMJ，在40g/L多聚甲醛液中固定24小時。然后在8mol／L甲酸和1mol／L甲酸鈉等量混合的脫鈣液中脫鈣1周。流水沖24小時，常規脫水、透明、浸蠟包埋，4μm厚石蠟切片。分別行HE染色，SP免疫組織化學染色，灰度測量。

1.4 統計處理 所有數據均采取均數±標準差表示，統計方法按照重復測量方差分析，采用SPPS13.0統計軟件，以P＜0.05為差異顯著。

2.結果

2.1 大體觀察 實驗中，FS組有尖叫，跳躍，翹尾，豎毛等行為表現；PS組有豎毛，恐慌等行為表現。取材時，實驗組與對照組同性別大鼠平均體重相似，各組大鼠無意外死亡。

2.2 組織學表現 單視野中P物質顯陽性，主要分布在關節盤前、后帶，且多分布在近盤邊緣部，大多數陽性纖維由棕黑色膨體呈串珠狀構成。鏡下觀察PS 1周組陽性纖維密度最高(圖3)。對照組(圖2)、PS3周組陽性纖維密度較高(圖4)、PS5周組陽性纖維密度較低(圖5)，但各組間差異不明顯。

圖2 對照組關節盤的P物質染色(×100)

圖3 情緒應激1周組關節盤的P物質染色(×100)

圖4 情緒應激3周組關節盤的P物質染色(×100)

圖5 情緒應激5周組關節盤的P物質染色(×100)

2.3 HE染色(圖6) 對照組大鼠髁狀突軟骨由淺入深依次分為關節表面帶、增殖帶、纖維軟骨帶和鈣化軟骨帶。表面帶由與關節面平行的膠原纖維組成；增殖帶為許多密集的小細胞，即前軟骨細胞組成；纖維軟骨帶由圓形軟骨細胞組成。關節盤中央部分較薄，前后部分較厚，主要由纖維及軟骨成分組成。PS組1周組可見大鼠顳下頜關節下腔可見到明顯的脫落細胞，主要為滑膜細胞，髁突表面部分區域凹凸不平，表面膠原纖維水腫、松解。關節盤炎性反應明顯，PS組3周時病理性變化最為明顯，關節盤后帶出現纖維玻璃樣變、斷裂，嚴重區部形成裂隙，PS組5周時，髁突表面部分區域凹凸不平，表面膠原纖維水腫、松解。

圖6 對照組，情緒應激1、3、5周組大鼠顳頜關節HE染色)(×40)

2.4 圖像分析及統計學檢驗 圖像分析表明，P物質陽性纖維與對照組比較，有顯著性差異(P＜0.01)。對照組和PS1周組之間有顯著性差異(P＜0.05)，對照組和PS3周組、5周組之間差異不顯著(P＞0.05)。PS3周組、5周組比較1周有下降趨勢，但仍然高于對照組(圖7)。

圖7 SP陽性纖維灰度測量標記圖

3.討論

近年來的研究發現，情緒因素(心理社會因素)與TMD的發生，發展和治療效果有著密切的關系，甚至越來越多的學者認為TMD是一種心身疾病。學者們在研究中發現[6,7]，情緒因素如高水平應激、軀體不適、情緒障礙等在TMD的發病過程中扮演了重要的角色。本研究結果證實情緒因素對TMJ的微結構具有一定影響。

P物質與TMJ關系密切，TMJ關節囊、盤、盤周附著、滑膜及骨膜中均有P物質陽性纖維的分布[8]。P物質具有免疫調節作用，可促進肥大細胞脫落，釋放組胺及5羥色胺等各種傷害性刺激因子，如創傷、壓力、精神緊張和炎癥介質等，可能在骨組織重建以及骨折愈合過程中起調節作用。在感受力學刺激和局部代謝狀況與調節靶細胞(成骨、破骨細胞)功能之間起著聯絡作用[4]。P物質能夠誘導滑膜細胞中DNA和蛋白質的合成與分裂，促進滑膜細胞增生形成滑膜翳，導致關節表面滑膜組織過分生長，并與已知的滑膜細胞的另兩種刺激因子白細胞介素-1和腫瘤壞死因子相互作用，共同發揮對滑膜細胞的作用。在病理刺激下P物質不僅順行傳入中樞表達痛覺信息等，而且被逆行釋放于局部組織中引起無菌性炎癥反應，其濃度的高低與患者的疼痛密切相關[9]。本研究結果說明大鼠TMJ在情緒應激狀態下發生的一系列病理性改變中，P物質神經肽可能參與了這種病理過程，并且在病變的初期可以出現明顯的疼痛癥狀，而隨著時間的延長，疼痛癥狀可能會有所減輕。

在臨床中我們有時會發現，有些患者疼痛癥狀并不嚴重，但是，在關節鏡下我們可以看到TMJ有明顯的炎性組織存在，再也正好與我們的實驗結果相一致。所以，對TMJ病的治療，我們在藥物治療和手術治療的同時，更應從機體功能紊亂和心理疾病兩方面因素對TMD進行評估[10,11]。

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