毛細管電泳法測定天山花楸中的黃酮類化合物

馬曉麗， 常軍民， 李毓斌， 孟 磊

(1.新疆醫科大學分析測試中心;2.新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830054)

天山花楸Sorbus tianschanicaRuper.為薔薇科Rosacea花楸屬Sorbus植物天山花楸Sorbus tianschanicaRuper.的干燥嫩枝葉，主產于新疆的天山山脈，是維吾爾民間習用藥材之一，藥理學研究證明其具有鎮咳、祛痰、平喘、強心和保護心肌缺血等作用［1－2］。黃酮類化合物在天山花楸中分布較廣，是其主要活性成分之一［3］。

天山花楸中黃酮類成分的檢測方法大多采用HPLC法［4－9］而且多為單一成分檢測。高效毛細管電泳法［10－12］是近年發展起來的一種具有高效、靈敏和低耗的分析方法，已廣泛應用于中草藥的活性成分測定。本實驗首次采用高效毛細管電泳法研究天山花楸干燥枝葉中的3種黃酮類成分(蘆丁、金絲桃苷和槲皮素)，旨在建立一種簡單、快速能同時分離測定天山花楸中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量的方法，以期為天山花楸資源的開發和利用提供基礎依據。

1 儀器與試藥

Beckman P/ACETM MDQ型高效毛細管電泳儀(Beckman公司，美國)，二極管陣列檢測器，石英毛細管柱(58.5 cm × 75 μm，有效長度 48.5 cm，河北永年);FE20－pH 計(METTLER TOLEDO公司);XS205電子天平(METTLER TOLEDO)。

蘆丁、金絲桃苷和槲皮素對照品均購于中國藥品生物制品檢 定 所 (批 號 分 別 為:100080－200306，111521－200303，100081－200406)。天山花楸采自新疆呼圖壁縣林場，并經新疆醫科大學藥學院生藥教研室帕麗達.阿不力孜教授鑒定。試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 電泳條件

石英毛細管柱(58.5 cm×75 μm，有效長度48.5 cm);運行緩沖液:10 mmol/L的Na2B4O7－20 mmol/L的NaH2PO4(pH8.30);分離電壓20 kV(+)→(－);電泳時間20 min;電泳溫度25℃;壓力進樣0.5psi×20s;柱上檢測UV 254 nm(二極管陣列檢測器)。清洗程序:第一次進樣前分別以甲醇、雙蒸水、0.1mol/L鹽酸、雙蒸水、0.1mol/L NaOH、雙蒸水、緩沖溶液沖洗毛細管20psi×3min;每次進樣間用0.1 mol/L NaOH 沖洗20psi×5 min，雙蒸水沖洗20psi×5 min，最后用緩沖溶液沖洗20psi×5 min。每變換一次電泳緩沖液，均用緩沖液平衡至電流平穩(10 min)后才能進樣測量。樣品及緩沖液均在4℃儲存，在使用前用0.45 μm微孔濾膜濾過，且臨用前超聲脫氣處理。

2.2 對照品貯備液的制備

分別精確稱取蘆丁、金絲桃苷及槲皮素對照品各10.0 mg，置于10 mL量瓶內，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為1 mg/mL的對照品貯備液;放置－4℃冰箱中保存，在使用前按要求稀釋。

2.3 供試品的制備

樣品研磨均勻，過20目篩，精密稱取5.0 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加甲醇50 ml超聲提取(30 min×3)，合并提取液，4 000 r/min離心15 min，取上清液將甲醇揮盡，用水溶解，再用乙醚萃取，將水溶液濃縮至10 mL，搖勻，制成供試品溶液，放置－4℃冰箱中保存。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取0.0625，0.125，0.185，0.25，0.375 mL 蘆丁對照品貯備液置于5個10 mL量瓶中，并依次加入金絲桃苷對照品貯備液 0.125、0.25、0.375、0.5、0.67 mL 及槲皮素對照品貯備液 0.025、0.05、0.075、0.1、0.13 mL，后用甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對照品混合液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，以相應進樣濃度為橫坐標進行線性回歸。結果表明混合標準品在線性范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系，結果見表1，電泳圖見圖1。

圖1 蘆丁、金絲桃苷、槲皮素混合標準品的CZE圖

表1 蘆丁、金絲桃苷、槲皮素線性關系考察結果

2.5 進樣精密度考察

考察所建立方法在相同操作條件下短時間內的精密度:取對照品混合液(蘆丁25 μg/mL，金絲桃苷50 μg/mL，槲皮素10 μg/mL)，連續5次重復進樣分析每次進樣20 s，測得蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品峰面積的RSD分別為0.9%，1.2%，2.7%。遷移時間的 RSD分別為0.14%、0.13%、0.14%。結果表明，此分析方法精密度好。

2.6 穩定性實驗

取對照品混合液(蘆丁25 μg/mL，金絲桃苷50 μg/mL，槲皮素10 μg/mL)，每隔2 h連續12 h考察樣品的日內穩定性，每次進樣20s。測得蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對照品峰面積的RSD分別為1.7%，1.8%，2.7%。遷移時間的RSD分別為0.80%、1.04%、1.36%。結果表明蘆丁、金絲桃苷及槲皮素對照品溶液的日內穩定性好。

2.7 方法重現性實驗

取同一批次天山花楸樣品各6份，按2.3項下操作制備樣品溶液，經測定樣品中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素峰面積的RSD%分別為1.1%，0.4%，2.6%，遷移時間的RSD%分別為0.14%，0.12%，0.10%。結果表明，該方法對蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量測定具有較好的重現性。

2.8 加樣回收率

取已知含量的樣品，定量加入混合對照品，以2.3項進行處理，重復測定6次，測得吸收峰面積，計算回收率，結果見表2。

表2 回收率測定結果(n=6)

2.9 樣品測定

取不同時間采集的天山花楸樣品，每種樣品按照供試品制備方法值得天山花楸供試品液3份，使用前精密吸取貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣分析。采用外標法測定樣品，計算含量，結果見表3，電泳圖見圖2。

表3供試品測定結果

3 討論

電泳緩沖液對分離的影響:實驗結果表明，在相同實驗條件下，使用Na2HPO4－NaH2PO4時，3種黃酮類成分分離不好，峰拖尾嚴重;在Na2B4O7－NaH2PO4時，由于黃酮類化合物在堿性條件下可與硼酸根離子絡合從而增加溶解度減少吸附引起的拖尾，3種化合物達到基線分離，峰形對稱。緩沖液的酸度和濃度對分離具有明顯的影響。3種黃酮類成分的分離度隨硼砂緩沖液pH值增加而提高，但當pH值過高時，電流增加過高，基線噪音增加，各峰的保留時間都增加，且出現拖尾現象，在硼砂濃度為10 mmol/L，緩沖液pH8.3時，得到較理想的CZE分離效果，3種成分的分離度R＞1.5。本實驗還考察25，20，15，10，5 kV等不同CZE電壓條件對樣品分離的影響。結果表明，當分離電壓低于15 kV時，電流減小，譜峰展寬;電壓為20 kV，電流穩定，分離效果良好;同時柱溫考察結果表明，25℃柱溫較為理想，大于或小于此溫度，各組分對照品的CZE峰不能達到完全基線分離。

圖2

通過CZE分離條件的優化，本實驗選擇緩沖體系為10 mmol/L 的 Na2B4O7－20 mmol/L 的 NaH2PO4(pH8.30)，電壓20 kV，柱溫25℃的CZE分離體系，能得到較理想的分離效果。

4 結論

本實驗在優化的電泳條件下對天山花楸中的黃酮類成分(蘆丁、金絲桃苷及槲皮素)進行了含量測定。結果表明，不同采集年份的天山花楸中黃酮類成分的含量存在一定的差異，2007年采集的天山花楸中金絲桃苷含量最高。采用毛細管電泳法測定天山花楸中黃酮類成分具有簡便、快速、準確、低耗等特點，適合于天山花楸中黃酮類組分的含量測定。

［1］艾買提江，開麗曼，陳 堅.花楸屬藥用植物的自然資源初探［J］.中國民族醫藥雜志，2004，6(5):38－40.

［2］李迪民，陳 堅，王 巖.天山花楸水煎提取液藥理學研究［J］.中草藥，1996，26(6):302－305.

［3］李迪民，陳 堅.天山花楸醇提物藥理學研究［J］.西北藥學雜志，1998，13(2):10－11.

［4］楊玲玲，常軍民，姚 軍.HPLC法測定天山花楸中的苦杏仁苷［J］.華西藥學雜志，2007，22(5):589－590.

［5］郁韻秋，龔祎珈，李 端，等.高效液相色譜法同時測定羅布麻浸膏粉中金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的含量［J］.復旦學報，2007，46(3):417－420.

［6］李景莊，胡君萍，楊建華，等.HPLC－UV法測定天山花揪中金絲桃昔和蘆丁的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29(2):310－312.

［7］胡君萍，楊建華，張 煊.反相高效液和色譜法同時測定新疆貫葉連翹中蘆丁和金絲桃苷的含量［J］.藥物分析雜志，2003，23(5):363－364.

［8］李 樂，李 鵬，張 芹，等.HPLC法測定天山花楸中蘆丁的含量［J］.四川中醫，2008，26，(9):51－52.

［9］張 芹，唐 輝.天山花楸中總黃酮和槲皮素的測定［J］.石河子大學學報(自然科版)，2006，24(6):359.

［10］鄭春英，劉松梅，李宏濤，等.毛細管電泳法同時檢測刺五加葉中的蘆丁和金絲桃苷含量［J］.中國藥學雜志，2008，43(10):784－785.

［11］徐兩軍.毛細管電泳－紫外檢測益母草中的黃酮類化合物［J］.福州大學學報，2006，34(6):909－911.

［12］孟美佳，曾海松，李 靜，等.毛細管電泳法測定不同產地羅布麻葉中的5 種黃酮類化合物［J］.2010，30(3):405－408.