UPLC測定超聲提取冬凌草中冬凌草甲素的含量

趙 鵬， 余旭亞， 黃遵錫 ， 唐湘華， 李俊俊

(1.生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，云南昆明 650092;2.云南師范大學生命科學學院，云南昆明 650092;3.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650224)

冬凌草學名碎米亞，是唇形科香茶菜屬植物Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara又稱Isodon rubescens(Hemsl.)C.Y.Wu et Hsuan。冬凌草甲素是冬凌草中主要活性成分，在體內和體外均具有較強的抗腫瘤和抗菌活性［1-3］，其分析方法有比色法［4］、薄層掃描法［5］、HPLC［6］和 HPCE［7］等。其中比色法和薄層掃描法存在定量不準確的缺點;HPCE法雖然快速、試劑用量少且柱不易受污染而優于HPLC，但是進樣精度較HPLC低，存在重現性較差、線性范圍窄和靈敏度較低等缺陷。目前HPLC法是較為常用的冬凌草甲素的測定方法。本實驗采用UPLC測定冬凌草中冬凌草甲素含量，比常規HPLC省時9 min以上，是一種簡便、快捷、高效、準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

ACQUITY UPLC(美國 Waters公司)，ACQUITY UPLC PDA檢測器(美國Waters公司)，Empower 2色譜數據工作站(美國 Waters公司);超聲波提取器(Automatic Science，60W);冬凌草甲素對照品購自西安旭煌生物技術有限公司(批號090621);冬凌草全草藥材購自市場;乙腈(美國Fisher公司，色譜純);甲醇(AR);水為超純水。

1.2 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18超高效色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);柱溫40℃;樣品室溫度8℃;檢測波長242 nm，進樣量為 1 μL。

表1 洗脫梯度

1.3 對照品貯備液的制備

準確稱取冬凌草甲素對照品5.5 mg，甲醇溶解并定容到25 mL，制得0.22 mg/mL的冬凌草甲素對照品溶液。

1.4 樣品溶液的制備

取冬凌草全草藥材，粉碎過40目篩，精密稱取1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL稱重，超聲處理40 min，放至室溫，稱重，用甲醇補至原重，過濾，取濾液2 mL，甲醇定容至10 mL，經微孔濾膜(0.22 μm)濾過作為供試樣品溶液。

2 結果與討論

2.1 系統適用性試驗

樣品溶液及對照品溶液依次進樣，獲得色譜圖(見圖1)。可以從圖中看出，冬凌草甲素與相鄰峰的分離度達到完全基線分離。

圖1 冬凌草甲素對照品(A)和冬凌草全草(B)UPLC圖

2.2 線性關系考察

精確吸取對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0 μL 按文中1.2項下色譜條件分別進樣，以對照品溶液進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，計算回歸方程為Y=3×106X+25246，r=0.999 7，冬凌草甲素進樣量在0.022～0.44 μg呈良好的線性關系。

2.3 樣品溶液穩定性試驗

取冬凌草粗粉(樣品1)，按文中1.4項下制備樣品溶液，在0、2、4、6、8、12 h 按1.2 項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積平均值為346 273，RSD 1.04%。結果表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.4 進樣精密度試驗

取冬凌草粗粉(樣品1，湖北金貴)，按1.4項下制備樣品溶液，按1.2項下色譜條件進樣5次，測得冬凌草甲素平均含量為6.662%，RSD 0.35%，表明進樣精密度較好。

2.5 重復性試驗

取冬凌草粗粉(樣品1)5份，按1.4項下方法制備，按1.2項下色譜條件分別進樣測定，測得平均含量為6.744%，RSD 1.93%，表明方法的精密度較好。

2.6 回收率試驗

分別精密吸取0.192 mg/mL的冬凌草甲素對照品溶液5份，每份2 mL，分別加入約1 g已知含量的冬凌草粗粉(樣品1)中。按1.4項下方法處理，按1.2項下色譜條件分別進樣，冬凌草甲素的平均回收率為97.3%，RSD 1.05%，結果見表2。

2.7 樣品測定

采用文中1.4項下方法，對多個不同來源的冬凌草樣品進行處理，用文中1.2項下色譜方法進行測定，記錄峰面積，計算冬凌草甲素的含量。見表3。

表2 冬凌草甲素回收率試驗結果(n=5)

表3 冬凌草全草藥材中冬凌草甲素含量測定結果(n=5)

3 結論

本實驗采用UPLC對冬凌草藥材中冬凌草甲素的含量進行測定，與常用的 HPLC測定方法［6，8-9］相比，在保持較高的準確度和精密度的同時，提高了分析效率。甲素的保留時間從10 min以上縮短為1.361 min，出峰時間縮短了9 min以上，分析時間縮短至3 min以內，在分析時間大幅縮短的同時，減少了溶劑的損耗和廢液的處理費用，節省了分析成本，為提高冬凌草的質量控制及其新產品的開發利用提供了一種更為快速準確測定方法。

［1］Kadota S，Basnet P，Ishii E，et al.Antibacterial activity of trichorabdal A from Rabdosia trichocarpa against Helicobacter pylori［J］.Zentralblatt Für Bakteriologie，1997，286(1):63-67.

［2］Chen S，Gao J，Halicka HD，et al.The cytostatic and cytotoxic effects of oridonin(Rubescenin)，a diterpenoid from Rabdosia rubescens，on tumor cells of different lineage［J］.Int J Oncol，2005，26(3):579-588.

［3］Liu J J，Huang R W，Lin D J，et al.Oridonin-induced apoptosis in leukemia K562 cells and its mechanism ［J］.Neoplasma，2005，52(3):225-230.

［4］趙清治，晁金華，王漢清.注射劑“癌得寧”中冬凌草甲素含量的紫外分光光度定量測定［J］.河南醫學院學報 醫學版，1981，16(2):351-354.

［5］袁 珂，胡潤淮.薄層掃描法測定冬凌草中冬凌草甲素的含量［J］. 中藥材，1997，20(5):242-243.

［6］袁 珂，呂潔麗，賈 安.超聲提取HPLC法測定冬凌草中冬凌草甲素［J］. 中草藥，2005，36(12):1823-1824.

［7］賈 欣，高 巖，杜 斌，等.HPCE法測定冬凌草片中冬凌草甲素的含量［J］. 鄭州大學學報，2006，41(1):156-157.

［8］冀春茹，馮衛生，胡潤淮，等.HPLC法測定冬凌草萜含片中冬凌草甲素的含量［J］.中國現代應用藥學雜志，1999，16(5):35-36.

［9］李可強，王 坤，張振秋.HPLC切換波長法同時測定冬凌草片中迷迭香酸和冬凌草甲素含量［J］.中成藥，2008，30(4):526-528.