逍遙散高效液相色譜指紋圖譜的研究

李會娟， 張 寧*， 李秋紅， 王業秋， 王發善， 陳巧云

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040;2.多多藥業有限公司，黑龍江佳木斯 154007)

逍遙散源于《太平惠民和劑局方》，具有疏肝解郁、調和氣血的功效，是治療肝郁脾虛的常用方劑［1］。逍遙散在臨床上廣泛應用于婦科、肝膽病、胃腸病、神經官能癥、心腦血管病及糖尿病、腫瘤等軀體疾病繼發的抑郁狀態［2-3］。吳麗麗等［4］、張崇燕等［5］采用自主活動、小鼠懸尾實驗和強迫游泳等方法均證明逍遙散有明顯的抗抑郁作用，丁國安等［6］臨床觀察逍遙散加味聯合米氮平治療產后抑郁癥，效果良好，不良反應少。

逍遙散由八味藥組方，其成分復雜，目前主要采用HPLC測定芍藥苷、阿魏酸、甘草甜素等少數成分的方法［7］，對逍遙散及其成方制劑進行質量評價，這不能全面反映其內在質量，需要一種全面、簡單易行的方法來評價逍遙散的質量。指紋圖譜能較全面地反映出組方中的成分［8］，因此本實驗應用HPLC對逍遙散進行指紋圖譜的研究，建立逍遙散指紋圖譜的共有模式，以實現多成分評價逍遙散及其成方制劑的質量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 series液相(G1322A Degasser，G1311A Quat Pump，G1329A ALS，G1316A TCC，G1315D DAD);Venusil XBP C18(天津博納艾杰爾科技有限公司)色譜柱;BT224S萬分之一電子天平(賽多利斯);KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004 A);中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 藥材與試劑 乙腈(色譜純;Burdick＆Jackson.);娃哈哈純凈水;甲醇、磷酸為分析純。逍遙散遵照《太平惠民和劑局方》并結合臨床用量，確定組方:柴胡 30 g、白芍 30 g、當歸 30 g、白術 30 g、茯苓30 g、甘草 15 g、薄荷10 g、炮姜 10 g，自制而成。以上藥材均購自北京同仁堂制藥集團哈爾濱藥店，經黑龍江中醫藥大學佳木斯學院陳孝忠副教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 逍遙散 取10批逍遙散組方藥材，粉碎，過2號篩，按組方比例混合。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 準確稱取逍遙散 1.85 g，加甲醇 20 mL，超聲提取兩次(30 min，15 min)，合并濾液，蒸干，用甲醇定容為10 mL，溶液過0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.2.2 以逍遙散1.85 g計，按組方比例稱取逍遙散各單味藥，提取方法同上。

2.3 色譜條件的確立

2.3.1 檢測波長的確定 190 nm～400 nm全波長掃描，經比較后發現280 nm處基線平穩，出峰多，故確定檢測波長為280 nm。

2.3.2 流動相的選擇 本實驗比較了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液4種流動相洗脫系統，結果乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫時峰的分離度和峰形都比較好，所以選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相。梯度見表1。

表1 流動相梯度Tab.1 The gradient of mobile phase

2.3.3 色譜柱的考察 實驗過程中考察了依利特ODS-2C18、依利特 ODS-C18、Thermo ODS-2C18、Venusil XBP C18色譜柱，比較后發現，Venusil XBP C18色譜柱出峰多，分離度好，故選擇Venusil XBP C18色譜柱進行逍遙散的成分研究。

2.3.4 色譜條件的確立 根據上述結果，最終確立的色譜條件為:色譜柱Venusil XBP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫 35 ℃;體積流量 1.0 mL/min;檢測波長280 nm;流動相乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度見表1。在上述色譜條件下，取供試品溶液進樣10 μL進行HPLC測定，結果見圖1。

圖1 逍遙散的指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of Xiaoyao Powder

2.4 共有峰的確定 按照2.1項制備逍遙散樣品10批，用2.3.4項下色譜條件測定了10批逍遙散的指紋圖譜，采用國家藥典委員會的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(版本2004 A)，確定22個共有峰(見圖2，表2)，其相對保留時間的RSD均小于1%。

2.5 參照峰的選擇 保留時間為40.6 min的色譜峰，峰面積較大，出峰時間適中且穩定，經標準品對照認定為甘草苷的吸收峰(見圖3)，因此選擇甘草苷作為參照物。

2.6 方法學考察

圖2 10批逍遙散的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 10 batches of Xiaoyao Powder

圖3 甘草苷標準品與逍遙散樣品對照色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of liquiritin and Xiaoyao Powder sample

表2 10批樣品出峰數目及共有峰所占比例Tab.2 The peak number of 10 batches of Xiaoyao Powder and the proportion of common peaks

2.6.1 精密度實驗 取同一供試液相同條件連續進樣5次，記錄指紋圖譜。結果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1%，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復性實驗 按2.1項制備5份供試品溶液，分別進樣10 μL，記錄指紋圖譜。結果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，符合指紋圖譜要求，重復性良好。

2.6.3 穩定性實驗 取同一供試液分別在0、4、8、16、24 h進樣，記錄指紋圖譜。結果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，說明供試樣品在室溫下24 h內穩定性良好。

2.7 相似度計算 采用國家藥典委員會的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(版本2004 A)，對10批逍遙散的指紋圖譜進行分析，以色譜峰的平均值建立對照指紋圖譜，利用相關系數法計算指紋圖譜的相似度，均不小于0.99，結果見表3。

表3 逍遙散10批相似度計算結果(S:共有模式)Tab.3 Similarity caculations of 10 batches of Xiaoyao Powder(S:the common pattern of Xiaoyao Powder)

2.8 共有峰歸屬認定 利用平均值生成逍遙散的共有模式(見圖4)。以逍遙散比例按2.2項下制備逍遙散各單味藥及其陰性對照組方的樣品，用2.2.4項下色譜條件進樣生成指紋圖譜，以保留時間和光譜確認各共有峰的來源(見圖4)。來源于白芍的是:2、3、5、6、12 號峰，來源于當歸的是:1、2、4、5、6、8、9、11、14、20、22 號峰，來源于甘草的是 6、7、10、16、18號峰，來源于薄荷的是 13、15、17 號峰，來源于炮姜的是19、22號峰，其中2、5號峰是白芍和當歸共有成分，6號峰是白芍、當歸和甘草共有成分，22號峰為當歸和炮姜的共有成分。21號峰在單味藥中未找出其來源，可能是在樣品制備過程中藥物相互作用產生的新成分。在逍遙散的八味藥中柴胡、茯苓、白術沒有色譜峰顯示在共有模式中。

圖4 逍遙散與單味藥對照色譜圖和各共有峰紫外光譜圖(x軸:nm，y軸:mAU)Fig.4 HPLC chromatogram of Xiaoyao Powder and single Chinese medicine and UV spectrum of common peaks

3 討論

3.1 本實驗建立了逍遙散的HPLC指紋圖譜，采用國家藥典委員會的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(版本2004 A)，生成了逍遙散指紋圖譜的共有模式，確定了22個共有峰，計算了10批逍遙散的指紋圖譜的相似度，均在0.99以上，且各色譜峰相對保留時間穩定，這說明本試驗方法所建立的指紋圖譜具有較好的穩定性和可控性，可以從整體定性評價逍遙散的質量優劣。同時，本實驗明確了22個共有峰的生藥歸屬，為逍遙散的定量指標的選擇和確定提供了參考。

3.2 中藥復方是中醫藥應用于臨床的經驗總結，傳統研究的水平限制了中藥復方的發展。中藥復方藥效物質基礎不清楚，藥效不明確阻礙了中藥復方走向世界。逍遙散是臨床常用的經典方劑，但其藥效物質基礎不明確。楊玉興等［9］對肝郁脾虛患者口服加味逍遙散后阿魏酸的藥動學進行研究，但單成分不能完全闡述逍遙散的藥效作用機制。指紋圖譜技術是量化表達和解析中藥藥效物質基礎整體特征的重要手段［10］，本實驗指紋圖譜技術所建立的逍遙散體外全成分分析方法，為逍遙散體內成分研究、藥效物質基礎的確定以及配伍規律的解析等奠定了扎實的基礎。

［1］李 冀.方劑學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2006:91-92.

［2］王曉強，高權國.逍遙散的藥理研究進展［J］.中醫藥信息，2007，24(1):40-42.

［3］修 春，宓穗卿，王寧生.逍遙散的藥理研究進展［J］.中國藥房，2007，18(9):702-703.

［4］吳麗麗，徐志偉，嚴 燦，等.逍遙散和丹梔逍遙散抗抑郁作用的實驗研究［J］.中醫研究，2003，16(3):14-15.

［5］張崇燕，唐永鑫，曾 南，等.逍遙散及其組方對行為絕望抑郁模型小鼠的影響［J］.成都中醫藥大學學報，2009，32(2):51-53.

［6］丁國安，余國漢，梁紹材，等.逍遙散加味聯合米氮平治療產后抑郁癥的臨床效果［J］.廣東醫學，2010，31(16):2163-2165.

［7］邱美賢.逍遙散復方配伍顆粒質量標準規范化研究［D］.廣州:廣州中醫藥大學，2006.

［8］許懷勇.中藥指紋圖譜在藥品質量控制中的應用［J］.醫藥導報，2009，(2):218-219.

［9］楊玉興，黃 熙，張航向，等.肝郁脾虛證患者口服加味逍遙散后血清阿魏酸藥動學研究［J］.北京中醫藥大學學報，2006，29(10):694-697，712.

［10］秦昆明，方前波，蔡寶昌，等.指紋圖譜在方劑現代研究中的應用現狀［J］.世界科學技術:中醫藥現代化，2009，(2):287-293.