紅花注射液熱轉化的HPLC/UV/MS特征圖研究

任愛農， 姚苗苗， 王大為

(1.江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京 210028;2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013)

紅花注射液是以菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.為原料制成的注射液，具有活血化瘀功能，臨床用于治療閉塞性腦血管疾病，冠心病，脈管炎。主要含有紅花中水溶性較強的黃色素類成分。近代研究表明紅花的黃色素類成分為活血化瘀的主要成分，可抑制血小板激活因子誘發的血小板聚集與釋放，為一血小板激活因子受體拮抗劑［1-4］，但是它的熱不穩定性也屢見報道［5-9］。我們曾采用HPLC方法對原藥材進行了檢測［10］，還采用了指紋圖譜檢測方法對紅花氯化鈉大輸液制備過程中的熱穩定性進行了跟蹤考察［11］;本實驗又應用 HPLC/UV/MS聯用技術對紅花注射液中熱轉化產物進行研究，將HPLC對復雜樣品的高分離能力與MS的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供分子質量與結構信息的優點結合起來，對紅花黃色素的熱不穩定性進行深層次的分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters-2695型HPLC色譜儀(四元泵、在線脫氣及自動進樣系統、2996型二極管陣列檢測器);Micromass公司Quattro micro質譜儀，串聯四極桿質譜檢測器，ESI接口，Masslynx 4.0數據處理系統;Milli-Q純水器(美國)。除乙腈為色譜純外，其余試劑均為分析純。

1.2 試劑與樣品 乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，超純水;紅花購于四川簡陽，由南京中醫藥大學劉訓紅教授進行品種和質量鑒定;紅花注射液(雅安三九藥業有限公司，規格:20 mL，批號:070407;亞寶藥業集團股份有限公司，規格:20 mL，批號:070110-1);羥基紅花黃色素A(批號111637-200502)購于中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備 取紅花注射液直接作為供試品(1);再取紅花藥材粉末(過3號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入雙蒸水100 mL，稱定質量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)40 min，放冷，再稱定質量，用雙蒸水補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液10 mL作為供試品溶液(2);再取續濾液50 mL置100 mL圓底燒瓶中100℃加熱回流2 h，作為供試品溶液(3)。取對照品羥基紅花黃色素A(safflomin A)用雙蒸水制成質量濃度為0.075 1 mg/mL對照品溶液。

2.2 色譜/質譜條件及分析方法 色譜柱Alltima C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相 乙腈(A)－0.2%乙酸(B)，梯度洗脫(0 ～30 min，10%A;30 ～50 min，15%A;50 ～ 55 min，25%A;55 ～ 60 min，10%A);體積流量 0.7 mL/min，檢測波長 403 nm，310 nm;柱溫30℃。柱后分流0.4 mL/min進質譜儀，同時記錄總離子流(TIC)色譜圖。檢測方式ESI(+/－);掃描范圍100～1 000;干燥氣體積流量;10 L/min;霧化室壓40 psi;毛細管電壓4 000 V;傳輸電壓70 eV。進樣量20 μL。

2.3 HPLC/UV/MS色譜圖的建立

2.3.1 色譜分離 實驗過程中嘗試用水-甲醇、水-乙腈體系的分離，發現乙腈的洗脫能力較強，分離較好;在水相中加入乙酸使流動相體系呈弱酸性，能有效改善峰形和分離度，所以確立了2.2項下色譜條件對供試品和對照品進行分離;并且通過DAD檢測器在200～600 nm范圍內全波長掃描。供試品(1):當波長在403 nm時，10 min左右處呈現羥基紅花黃色素A色譜峰、21 min左右處又呈現出一個峰;波長在310 nm時33 min處又見一個明顯色譜峰。供試品(2):當波長在403 nm時10 min左右處呈現羥基紅花黃色素A色譜峰、21 min左右和42 min左右處又各出現一個明顯的吸收峰，310 nm波長時無明顯色譜峰，供試品(3)當波長在403 nm時羥基紅花黃色素A和21 min左右的峰仍然存在，42 min左右時的色譜峰消失，310 nm波長時33 min左右處新產生了一個明顯的吸收峰，所以，確立403 nm、310 nm為色譜圖的檢測波長。紅花注射液和紅花水提取液受熱前后的HPLC/UV的色譜圖見圖1。

2.3.2 質譜檢測 為全面檢測紅花注射液及紅花水溶液受熱成分變化情況，分別以正、負離子模式檢測。紅花注射液是以紅花為原料制成的注射液，其主要有效成分為查爾酮類物質。該類成分除21 min左右的峰僅適合在負離子模式下檢測，其余各峰在正、負離子檢測模式下均可檢測，但是在負離子檢測模式時效果更好。紅花注射液及紅花水溶液受熱前后的HPLC/MS TIC圖，見圖2。

圖2是在2.2質譜條件下進樣分析得到的負離子掃描圖，結合正離子掃描結果，各分子離子的信息見表1。

表1 圖2中推導的4個可能化合物Tab.1 The four possible compounds derived in Fig.2

2.4 質譜解析結果 由表1可見1號峰與羥基紅花黃色素A對照品比較可確定為羥基紅花黃色素A;2號峰可能是羥基紅花黃色素A的同分異構體;3號峰初步推測為查爾酮類物質;4號峰初步推測為橙酮類物質。

3 討論

圖1 紅花注射液和紅花水提取液受熱前后的HPLC/UV色譜圖Fig.1 HPLC/UV characteristic peaks of Honghua Injection and Carthami Flos extract water before and after being heated

圖2 紅花注射液和紅花水提取液受熱前后的HPLC/MS總離子流圖［ESI(－)］Fig.2 HPLC/MS total ion chromatograms［ESI(－)］of Honghua Injection and Carthami Flos extract water before and after being heated

3.1 由紅花注射液、紅花水提液受熱前后色譜圖可見10 min左右的羥基紅花黃色素A峰及22 min左右的峰對熱較穩定，在紅花藥材及紅花注射液中均出現;33 min左右時出現的峰為紅花水提取液受熱轉化的產物，紅花藥材中沒有，在紅花注射液中含有，說明該種成分是在紅花注射液制備過程中受熱轉化所致;42 min左右時的峰對熱不穩定，紅花藥材中有，紅花注射液中沒有，說明該物質在紅花注射液制備過程中受熱被破壞了。

3.2 紅花注射液所含成分復雜，并且由于紅花黃色素受熱不穩定的特點，增加了其特殊性。33 min左右時的峰是熱轉化產物，未見該物質有關報道，本文首次報道了該物質的熱轉化，但是，僅展示了該物質的分子量和紫外光譜特征，更深層次的結構特征和藥理活性有待于進一步研究。

3.3 42 min左右時出現的峰是原紅花藥材中固有的，量較高，可能具有類似紅花樣的作用，有文獻報道為紅花黃色素A(Safflower yellow A)，相對分子質量是594［12-13］，這可能是質譜設置參數時分子質量范圍窄濾除了分子質量大的物質而引起的。我們的研究結果分子質量是1 043，對此物質未見紅花成分研究中有關報道，可能是該物質對熱不穩定性失去了它的研究價值，這提示我們可通過分子修飾增加結構的穩定性。

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