木香藥材HPLC指紋圖譜的研究

李 力， 張振秋， 王 冰， 鄧雪男

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600)

木香為菊科植物木香Aucklandiae lappaDecne的干燥根［1］，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品［2］，其性溫，味辛、苦，歸脾、胃、大腸、膽、三焦經(jīng)，具有行氣止痛、健脾消食的功效［3-4］。木香中主要含倍半萜內(nèi)酯類化合物［5-7］，其中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的量較高［8］，二者的藥理活性明顯［9］。目前對木香的質(zhì)量研究中仍未見其HPLC指紋圖譜的相關(guān)報道，本實驗采用HPLC法構(gòu)建不同來源木香藥材的指紋圖譜，對10批木香藥材進(jìn)行了相似度評價，為整體控制和評價木香藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(四元梯度泵，在線真空脫氣機(jī)，儀器編號:20041191 DE43607375);G1314-A紫外檢測器;AS3120A超聲波清洗器;AR2140電子分析天平(上海奧豪斯公司);202-2型干燥箱(上海市實驗儀器總廠);METTLER AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士)。

1.2 試藥 木香烴內(nèi)酯對照品(批號:111524-200503)，由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。木香藥材樣品共10批，分別來源于全國10個地區(qū)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定，為菊科植物木香Aucklandiae lappaDecne的干燥根，藥材來源見表1。

樣品編號 來源 收集年月S1 廣東(廣州采芝林藥業(yè))2009-09 S2 上海(童涵春堂藥業(yè)) 2009-09 S3 山東(長清醫(yī)藥公司) 2009-10 S4 江蘇(南京老百姓藥房) 2009-10 S5 黑龍江(寶豐藥房) 2009-10 S6 四川(成都) 2009-11 S7 遼寧(沈陽紅太陽藥房) 2009-11 S8 北京(同仁堂) 2009-09 S9 河北(安國) 2009-09 S10 云南(昆明)2009-10

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Phenomsil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:甲醇(A)-水(B)梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL，梯度洗脫程序見表 2，所有組分均在70 min內(nèi)被洗脫。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2The schedules of mobile phase gradient elution

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取木香烴內(nèi)酯對照品1.98 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.079 2 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取木香樣品粗粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，放置過夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一木香藥材供試品溶液(樣品號10)，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，結(jié)果其共有峰的相對保留時間和相對峰面積 RSD 分別為 0.02% ～0.23% 和 0.22% ～1.9%，說明儀器精密度良好，符合指紋圖譜測定的要求［10-11］。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一木香藥材供試品溶液(樣品號10)，按2.1 項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測定，結(jié)果其共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.02% ～2.6%和1.5%～2.7%，說明供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批木香藥材粗粉(樣品號10)6份，按2.3項下供試品溶液的處理方法平行制得6份供試品溶液。按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果其共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明重復(fù)性好。

2.5 樣品指紋圖譜測定 分別取來自10個不同來源的木香樣品，按2.3項下供試品溶液制備方法得供試品溶液。按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄HPLC圖。比較不同來源樣品的色譜圖，其中13個色譜峰為10批樣品的共有峰，確定為共有指紋峰，其中9號峰為木香烴內(nèi)酯色譜峰，選作參照峰，設(shè)其保留時間和峰面積分別為1，其他各共有峰的保留時間和峰面積分別與參照峰的保留時間和峰面積相比，計算各樣品指紋圖譜中共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果分別見圖 1、2、3，表 3、4。

圖1 木香烴內(nèi)酯對照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of costunolide

圖2 10個木香樣品的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of 10 samples

圖3 木香藥材的HPLC指紋共有模式Fig.3 HPLC fingerprint mutual mode of Aucklandiae Radix

2.6 指紋圖譜的相似度計算［12］運用國家藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版對10批木香藥材的指紋圖譜進(jìn)行了相似度分析，將色譜工作站的數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計算軟件，選定上述13個特征峰進(jìn)行譜峰匹配，通過中位數(shù)矢量計算得出木香樣品指紋圖譜的共有模式，并依此共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評價。從表5可以看出，10批木香藥材的相似度均大于0.90，說明各地區(qū)的樣品色譜模式相似，其化學(xué)成分一致性較好。相似度評價結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 樣品處理方法的考察 考察了超聲、回流、冷浸等提取方法，其中超聲提取的樣品圖譜雜質(zhì)干擾少、色譜峰基線分離好，故選用超聲提取法提取。提取溶劑分別用甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯超聲提取30 min，結(jié)果表明甲醇提取雜質(zhì)少、提取完全，故選擇甲醇作為提取溶劑。分別超聲提取15 min、30 min、45 min，結(jié)果隨著提取時間的延長，色譜峰的面積有所增大，超聲提取30 min時提取較完全，超聲45 min提取所得的峰面積有所減小，所以提取時間選擇超聲30 min。

表3 10批木香藥材的相對保留時間Tab.3 Relative retention time of 10 samples

表4 10批木香藥材的相對峰面積Tab.4 Relative peak areas of 10 samples

表5 木香樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果Tab.5 Similarity analysis results of Aucklandiae Radix

3.2 色譜條件的選擇 試驗過程中選擇了多種流動相系統(tǒng)(等度洗脫，梯度洗脫):甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水(0.05%)等流動相系統(tǒng)洗脫，并對梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明以甲醇-水系統(tǒng)，實驗所確定的梯度程序使各色譜峰達(dá)到基線分離，峰型對稱，分離較好，保留時間適中。實驗比較了20℃、30℃、40℃ 3個不同柱溫，發(fā)現(xiàn)隨柱溫上升各色譜峰保留時間提前，在40 min后出現(xiàn)的色譜峰變化幅度較大，在30℃時檢測相對保留時間穩(wěn)定，因此選擇30℃為指紋圖譜的檢測柱溫。

3.3 從不同來源木香藥材的指紋圖譜中可以看出，各特征峰的相對保留時間相似度較高，可用于木香藥材的圖譜鑒別，但峰面積比值不盡相同，差異較大，說明木香藥材的質(zhì)量受地理環(huán)境和氣候條件影響較大，因此木香藥材生產(chǎn)必須固定地區(qū)，才能確保其質(zhì)量的穩(wěn)定可控。

3.4 10批木香藥材指紋圖譜的相似度均在0.90以上，說明按本方法進(jìn)行指紋圖譜分析，其相似性良好。所建立的標(biāo)準(zhǔn)對照色譜指紋圖譜，峰的數(shù)目、強(qiáng)度及分離度均較理想，滿足了指紋圖譜的要求，并且通過方法學(xué)考查試驗驗證，本試驗具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，所以本方法可對木香藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。

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