玉屏風顆粒治療過敏性鼻炎的實驗研究

文 潔， 朱建梅， 李 婕， 袁廣明， 向飛軍

(1.中山大學藥物開發(fā)中心，廣東 廣州 510080;2.中山大學中山醫(yī)學院，廣東 廣州 510080;3.廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東順德 528000)

玉屏風散［1］由黃芪、白術、防風三味中藥組成，可益氣固表，是中醫(yī)的經(jīng)典方。本研究通過建立卵蛋白致大鼠和豚鼠過敏性鼻炎模型［2］，探討玉屏風顆粒對過敏性鼻炎的治療作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 清潔級Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量150～250 g，合格證號:粵監(jiān)證字2008A011;豚鼠，雌雄各半，350 ～450 g，合格證號:粵監(jiān)證字2007A051，普通級。均購于中山大學實驗動物中心。

1.2 藥物和試劑 玉屏風顆粒，廣東環(huán)球制藥有限公司，批號:081105，實驗時按需要配制成1/3臨床用劑量、臨床用劑量及三倍臨床用劑量3種濃度藥液備用。鼻炎康片，佛山德眾藥業(yè)有限公司，批號:08218，每片重0.37 g(含馬來酸氯苯那敏1 mg)。吸附無細胞白百破聯(lián)合疫苗，成都生物制品研究所，規(guī)格0.5 mL/支，批號:20071013-1。卵蛋白片，國藥集團化學試劑有限公司，批號:F20070827。伊文斯藍，批號e-2129，進口分裝，Sikema公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 對卵蛋白致大鼠過敏性鼻炎的治療作用 參照文獻［3-4］并改進，建立大鼠過敏性鼻炎模型:大鼠前肢和后肢跖，分別注射0.1 mL 1%卵蛋白(OVA)生理鹽水液和0.2 mL白百破聯(lián)合疫苗;5 d后以0.5%OVA生理鹽水液1 mL注入大鼠背部。初次致敏后第7天開始，1%OVA滴鼻激發(fā)，10 μL/(次·d)，維持到實驗結(jié)束。每7天記錄一次1%OVA滴鼻后大鼠撓鼻、噴嚏次數(shù)及清涕出現(xiàn)的輕重程度，觀察時間為30 min。用PCA試驗檢測IgE抗體效價:致敏后第14天，從同致敏天數(shù)各組動物中分別各取2只大鼠腹腔靜脈采血，離心分離得血清，并按1∶1、1 ∶16、1 ∶18 比例稀釋，分別取 0.1 mL上述稀釋好的各種血清注射于正常未致敏大鼠背部皮內(nèi)。48 h后，尾靜脈注射1 mL含1 mg卵蛋白和10 mg伊文思藍的生理鹽水溶液，30 min后處死大鼠，剝離背部皮膚，測量藍色斑點直徑，大于5 mm判定為陽性。于致敏后第21天、第28天、第35天，分別按上述操作重復進行一次，以判定實驗過程中各實驗組大鼠血清中IgE抗體效價的變化。致敏后第14天，選取鼻炎癥狀積分3分以上大鼠，隨機分成6組，每組12只。分別為模型組、玉屏風顆粒高、中、低劑量組，鼻炎康(陽性對照)組。另設正常組大鼠12只，給予同容積飲用水，雙側(cè)鼻孔滴入生理鹽水。各組均在OVA滴鼻前1 h灌胃給藥，共給藥3周。在OVA滴鼻30 min內(nèi)觀察鼻炎癥狀，記錄撓鼻、噴嚏次數(shù)及清涕出現(xiàn)的輕重程度，每7天觀察一次。用積分迭加法評分(撓鼻:抓撓3次為1分，3～10次2分，抓撓不止3分;噴嚏:1～3個為1分，3～5個2分，連續(xù)噴嚏3分;清涕:流到鼻前孔1分;超過鼻前孔2分;涕流滿面3分)。

2.2 對卵蛋白致豚鼠過敏性鼻炎的治療作用 參照文獻［4-6］并改進，建立豚鼠過敏性鼻炎模型:豚鼠兩后肢四頭肌，分別注射5%卵蛋白(OVA)生理鹽水液各0.4 mL，腹腔注射5%OVA 1 mL。初次致敏后第7天開始，2.5%OVA 滴鼻激發(fā)，10 μL/(次·d)，維持至實驗結(jié)束。致敏后第14天，根據(jù)鼻炎癥狀選取合格豚鼠隨機分成5組，每組10只。分別為模型組、玉屏風顆粒高、中、低劑量組，鼻炎康(陽性對照)組。另設正常組豚鼠10只，給予同容積飲用水，雙側(cè)鼻孔滴入生理鹽水。各組均在OVA滴鼻前1 h灌胃給藥，共給藥兩周。

對各給藥組流清涕動物進行計數(shù)，每天1次，按癥狀好轉(zhuǎn)率評分，比較組間差異。各組動物總數(shù)—流清涕動物數(shù)/各組動物總數(shù) ×100%=癥狀好轉(zhuǎn)率。連續(xù)給藥第10天后，將各實驗組豚鼠缺氧處死一半;給藥后第14天，處死剩余的一半;取動物鼻中隔黏膜組織，每組還各取2只豚鼠肺下葉組織，經(jīng)脫鈣、脫水包埋、染色切片。鏡下觀察所有實驗組豚鼠鼻黏膜的嗜酸性粒細胞、淋巴漿細胞浸潤、腺體增生以及柱狀上皮鱗化程度、支氣管周圍、肺組織炎性病變情況，用迭加法計算各組病理觀察平均積分。

3 結(jié)果

3.1 玉屏風顆粒對OVA所致大鼠過敏性鼻炎的作用

3.1.1 鼻炎癥狀 從初次致敏第7天開始，抗原攻擊后動物撓鼻、噴嚏的次數(shù)，流清涕程度逐天增加，卵蛋白致敏第14天，動物造模成功(P＜0.01)。將造模成功的動物隨機分為6組給藥。用藥第7天，玉屏風中劑量、低劑量組鼻炎癥狀反應有明顯改善(P＜0.01、P＜0.05);用藥第14 天，玉屏風中劑量組可明顯改善鼻炎癥狀(P＜0.01)，玉屏風高、低劑量組鼻炎癥狀積分有減輕趨勢;用藥第21天，各給藥組鼻炎癥狀與模型組比較仍有減輕趨勢，但已無顯著性差異(P＞0.05)見表1。

3.1.2 IgE抗體水平變化 致敏后第14天，造模動物血清樣本IgE抗體均呈陽性反應，皮內(nèi)藍斑均＞5 mm，血清IgE抗體達到最高值。用1%OVA滴鼻每天激發(fā)，在14～28 d之間能基本維持穩(wěn)定的IgE抗體效價1∶1、1∶6、1∶18以及鼻炎癥狀，而正常組動物始終沒能檢測出IgE。用藥后7 d，模型對照組血清樣本IgE抗體效價范圍在1∶1～1∶18;而玉屏風顆粒治療組隨著給藥時間增加，IgE抗體滴度降低，效價范圍在1∶1～1∶6內(nèi)，1∶18抗血清樣本呈陰性。用藥后14 d，模型對照組與玉屏風顆粒治療組血清樣本效價范圍均為1∶1～1∶6。

3.2 玉屏風顆粒對OVA致豚鼠過敏性鼻炎的作用

3.2.1 鼻炎癥狀 從初次致敏第7天開始，抗原攻擊后動物撓鼻、噴嚏的次數(shù)，流清涕程度逐天增加，在OVA致敏第14天，挑選造模成功動物隨機分為6組后開始給藥。各治療組鼻炎癥狀隨給藥時間增加逐漸減輕，好轉(zhuǎn)率逐漸提高。給藥第4天開始，玉屏風高、中、低劑量組及鼻炎康組癥狀好轉(zhuǎn)率開始明顯上升;給藥第6天，玉屏風中、低劑量組鼻炎癥狀明好轉(zhuǎn)率均﹥70%;給藥第10天時，玉屏風中、低劑量組鼻炎癥狀好轉(zhuǎn)率均﹥80%以上;在連續(xù)給藥14 d后，組間方差分析結(jié)果顯示，與模型對照組比較，玉屏風中劑量組、鼻炎康陽性組均有顯著性差異，P＜0.05，F(xiàn)=3.45。見圖1。

圖1 豚鼠鼻炎癥狀組間好轉(zhuǎn)率比較Fig.1 The improvement rate of allergic rhinitis symptoms

3.2.2 鼻黏膜組織學觀察 正常組動物幾乎無鼻黏膜嗜酸細胞(EOS)浸潤，經(jīng)反復給予OVA抗原攻擊后，模型組鼻黏膜潰瘍、腺體增生以及充血水腫比較明顯，尤以EOS浸潤明顯增多(P＜0.01)，表明EOS浸潤在OVA過敏性鼻炎模型發(fā)病機理中起重要作用。連續(xù)給藥10 d后，玉屏風中、低劑量組上述病理學特征得到明顯改善(P＜0.01、P＜0.05)，改善效果呈正相關(P＜0.05)。連續(xù)給藥14 d后，各實驗組病理學改變與模型對照組比較已無顯著性差異(P＞0.05)。對模型對照組及各實驗組豚鼠肺組織、支氣管周圍組織學觀察，未發(fā)現(xiàn)EOS增多，上皮細胞增生，肺泡間隔變窄，局部充血等病理學改變。表明經(jīng)鼻腔的抗原激發(fā)方式，使變態(tài)反應局限于豚鼠的鼻腔。見表2、圖2。

4 討論

變應性鼻炎又稱過敏性鼻炎［7］，是以突發(fā)性及反復發(fā)作的鼻癢、噴嚏、鼻分泌亢進、鼻黏膜腫脹為主要癥狀特點的一種變態(tài)反應疾病，屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇，為耳鼻喉科常見病、多發(fā)病。過敏性鼻炎發(fā)病機制復雜，其中鼻黏膜嗜酸細胞(EOS)浸潤是過敏性鼻炎的重要病理學特征。近年來，致敏原檢測及全身免疫功能調(diào)節(jié)在臨床診斷和治療中受到重視，并開始選用相應藥物用于臨床治療。

玉屏風散出自元·朱丹溪的《丹溪心法》，是益氣固本之經(jīng)典方，其所治病證“肺氣虛證”既是變應性鼻炎的臨床常見證型之一，也是臨床各型變應性鼻炎患者長期反復發(fā)作后形成的易感體質(zhì)——肺氣虧虛體質(zhì)［8］。現(xiàn)代藥理研究證實，玉屏風散對免疫系統(tǒng)效應較為肯定，不僅對體液免疫(使IgA、IgG升高，使IgE降低)、單核巨嗜細胞系統(tǒng)、T淋巴細胞表現(xiàn)出明顯的增強作用，而且對紅細胞免疫也有增強作用［9-10］。本實驗通過玉屏風顆粒對大鼠和豚鼠兩種過敏性鼻炎動物模型治療作用研究表明，玉屏風顆粒可明顯改善大鼠和豚鼠的過敏反應，表現(xiàn)為血清IgE水平降低，過敏性鼻炎癥狀顯著緩解，使豚鼠鼻黏膜EOS浸潤減輕，鼻黏膜潰瘍、腺體增生以及充血水腫得到明顯改善，提示玉屏風顆粒可通過扶正脫敏，調(diào)節(jié)免疫反應著手治療過敏性鼻炎，有著很好的臨床應用前景。

表2 OVA豚鼠過敏性鼻炎模型病理觀察評分(給藥10 d后，n=5)Tab.2 The nasal pathological changes of the guinea pig allergic rhinitis models

圖2 鼻黏膜組織學觀察Fig.2 The nasal pathological change of the guinea pig allergic rchinitis models

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