靈芝酸單體Me腸溶膠囊制備及其兔體內生物利用度測定

陶少林， 陳 香， 高 峰*， 鐘建江

(1.華東理工大學上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237;2.華東理工大學藥學院藥劑教研組，上海 200237;3.上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240)

靈芝酸具有抗腫瘤、抗HIV-1病毒、調節免疫、鎮痛等功效，是靈芝的主要有效成分之一［1-2］，是當今研究的一大熱點。靈芝酸單體Me(簡稱GA-Me)具有抗小鼠 Lewis肺癌作用［3］，通過調節 IL-2和IFN-γ的表達，增強NK細胞活性，提高機體免疫水平，抑制腫瘤生長［4］。同時，GA-Me對機體免疫有一定的調節作用。由于GA-Me水難溶性和在酸性條件下易降解，使得口服給藥生物利用度較低［5］，影響其療效。β-環糊精(簡稱β-CD)包合物載藥系統是近年來發展起來的新方法，能有效提高難溶性藥物生物利用度［6］。我們制備了GA-Me-β-CD包合物腸溶膠囊，并對本品在兔體內的藥代動力學進行了研究。

1 儀器與材料

電子分析天平(AB104-N，梅特勒-托利多儀器)，LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津公司)，紫外-可見分光光度儀(TU-1800SPC，北京普析通用儀器有限責任公司)，80-2型離心機(上海藍凱儀器儀表有限公司)，LX-200離心機(海門市齊林貝爾儀器廠)，WH-微型渦旋混合儀(上海精科實業有限公司)，微量定量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司)，恒溫水浴箱(上海藍凱儀器儀表有限公司)。

GA-Me(純度＞99%，華東理工魯華生物所);苯丙酸諾龍(純度＞99%，上海順勃生物工程技術有限公司);β-CD(國藥集團上?；瘜W試劑公司);微晶纖維素(常熟市藥用輔料有限公司);微粉硅膠(常熟市藥用輔料有限公司);2號腸溶空膠囊(無錫長江膠囊有限公司);甲醇、乙酸、水為色譜純，其它試劑均為分析純。

新西蘭兔(體質量2.2～2.7 kg)，購于復旦大學實驗動物科學部，合格證號 SCXK(滬)2010-0011。

2 方法與結果

2.1 GA-Me-β-CD包合物制備 稱取一定量的β-CD置于研缽中，加入約占β-CD質量10% ～20%的水研磨5 min，使之成糊狀物。稱取計算量的GAMe溶解于乙醇加于研缽中，繼續研磨3 h，真空干燥備用。當主客分子比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1時，包合物質量濃度分別為(1.64 ±0.30)、(2.41 ±0.15)、(5.28 ±0.64)、(3.33 ±0.20)μg/mL。選擇主客分子比為3∶1制備包合物。

2.2 包合物量測定

2.2.1 測定波長的選擇 精密稱取 GA-Me 1 mg置10 mL量瓶中，加80%乙醇溶液定容，搖勻得GAMe標準溶液。在200～400 nm波長范圍內對β-CD、GA-Me及其包合物的80%乙醇液進行掃描。結果表明GA-Me在245 nm處有最大吸收，β-CD和包合物在此波長處無吸收。選擇245 nm作為GAMe含量測定的檢測波長。

2.2.2 標準曲線的制備 精密量取適量GA-Me標準溶液至100 mL量瓶中，加80%乙醇溶液定容至GA-Me 質量濃度分別為 0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、40 μg/mL，在245 nm處測定吸光度。以質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，經線性回歸后得標準曲線方程為y=0.027 4x+0.023 1，r=0.999 8。GA-Me質量濃度在0.5～40 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 包合物中藥物含量測定 精密稱取包合物約7 mg置100 mL量瓶中，加入80%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾后在245 nm處測定吸光度，代入標準曲線計算藥物量。結果表明7 mg包合物中GA-Me量為0.88 mg，在包合物制備過程中有12%的GA-Me降解。

2.3 包合物溶解度的測定 取過量GA-Me及其包合物分別置于10 mL具塞刻度試管中，加水適量，于室溫下振搖使之充分溶解達到平衡，離心后上清液0.45 μm微孔濾膜過濾，續濾液于245 nm處測定吸光度，代入標準曲線計算GA-Me在水中的溶解度。取3個批號包合物進行測定。GA-Me溶解質量濃度為(1.06 ±0.12)μg/mL，包合物溶解質量濃度為(5.28 ±0.64)μg/mL，溶解度提高了5 倍。

2.4 GA-Me-β-CD包合物腸溶膠囊的制備

2.4.1 GA-Me酸堿穩定性 配置pH值1～12系列水溶液，精密量取適量GA-Me標準溶液使得質量濃度均為25 μg/mL，每個pH配3個樣品，置于棕色玻璃瓶中。在不同時間點測定各pH值下GA-Me的量。結果表明5 min內GA-Me在pH值1～3條件下含量下降55% ～63%，在pH值6～8條件下含量下降1%～3%，提示制劑開發過程中應采用腸溶膠囊以避免胃液對GA-Me及其包合物的破壞作用。

2.4.2 腸溶膠囊的制備 以休止角作為粉末粒度選擇依據選擇包合物粉末粒度;選擇微晶纖維素為填充劑并加入適量微粉硅膠，以改善粉末的流動性和提高抗濕性能;選擇2號腸溶膠囊，150 mg作為單位膠囊劑。采用等量遞加法將包合物與微晶纖維素及微粉硅膠混合、過80目篩、填裝制得腸溶膠囊。

2.5 腸溶膠囊中主藥量的測定

2.5.1 標準曲線的制備 取空白膠囊10 mg溶解于50 mL 80%乙醇溶液中，在此溶液中加入適量GA-Me標準溶液，配置成GA-Me質量濃度分別為0.0、2.5、5.0、10、20、40 μg/mL 的溶液，在 245 nm處測定吸光度。以質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，經線性回歸后得標準曲線方程為y=0.026 9x+0.028 1，r=0.999 7。GA-Me 質量濃度在 2.5 ～40 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5.2 主藥含量測定 取3個批號的包合物膠囊各10 mg溶解于50 mL 80%乙醇溶液中測定GA-Me的量。結果表明每個單位膠囊劑中GA-Me量均在20 mg左右，RSD小于1.6%，不同批次膠囊之間的主藥量差異較小。

2.6 體外溶出度試驗

2.6.1 溶出介質的選擇 隨著表面活性劑(十二烷基硫酸鈉，SDS)含量增大，GA-Me溶解度逐漸增大;在含0.3%SDS的溶出介質中，可滿足釋放度測定的漏槽條件，選擇含0.3%SDS的人工胃液(pH 1.2的鹽酸溶液)、人工腸液(pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，PBS)作為溶出介質。

2.6.2 色譜條件［7］色譜柱為迪馬公司 Diamonsil?C18(250 mm ×4.6 μm，5 μm);流動相:甲醇-水(94∶6，用乙酸調pH至3.6);體積流量:1 mL/min;檢測波長:245 nm;柱溫:室溫;進樣量:20 μL。

2.6.3 樣品處理 定時取樣2 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，同時立即補加等量的溶出介質，精密取濾液0.5 mL，2 mL乙酸乙酯萃取，取上層有機相0.5 mL，40℃氮氣吹干，殘留物用流動相200 μL溶解，待測。

2.6.4 標準曲線制備 精密量取適量GA-Me標準溶液分別置于10 mL量瓶中，用PBS稀釋至GA-Me質量濃度分別為 0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL，搖勻作為供試品。按照2.6.2項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，以GA-Me峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線方程為:y=33 628x+1 673.3(r=0.999 7)。結果表明，GAMe質量濃度在 0.5 ～8.0 μg/mL 范圍內線性關系良好。平均回收率為98.07%，RSD為5.23%。

2.6.5 溶出度測定 按照轉籃法操作，每個操作容器中注入900 mL經脫氣處理的溶出介質，控制溫度在(37±0.5)℃，調整轉速至100 r/min。取本品膠囊一粒，用一小段耐腐蝕的金屬線輕繞膠囊外殼使其沉入底部，立即啟動機器，定時取樣2 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，按照2.6.3項下操作并進樣檢測，計算溶出度，繪制溶出曲線(圖1)。結果表明轉速為100 r/min時，在人工胃液中2 h藥物釋放百分率＜2%，在人工腸液中45 min時的溶出度均超過了標示量的80%，符合藥典規定。

圖1 GA-Me-β-CD包合物腸溶膠囊累積溶出曲線(n=5)Fig.1 The accumulative release curve of enteric-coated capsules of GA-Me-β-CD inclusion complex(n=5)

2.7 高溫高濕影響實驗 將包合物膠囊用自封袋簡單包裝，分別置于60℃、25℃、RH75%的密閉條件下于5、10 d取樣，測定膠囊中GA-Me量及1 h溶出度情況，并與0 d結果比較［8］。結果表明GA-Me腸溶膠囊在高溫及高濕條件下穩定，含量、外觀無明顯變化，但累積溶出量分別下降了4.34%、6.13%。提示包合物腸溶膠囊應注意密封包裝，且在低溫及干燥條件下保存。

2.8 兔體內血藥濃度的測定

2.8.1 色譜條件 參考2.6.2項色譜條件。采用內標法，內標物為苯丙酸諾龍。

2.8.2 溶液配置 精密稱取GA-Me、苯丙酸諾龍各5 mg置10 mL塑料離心試管中，加甲醇5 mL溶解，搖勻，得1 mg/mL的標準溶液，臨用前加流動相稀釋至濃度，置冰箱4℃保存備用。

圖2 (a)空白血漿、(b)空白血漿中加入GA-Me(2)和苯丙酸諾龍(1)及(c)兔靜脈給藥1 min后血漿樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank plasma from a rabbit(a)，of plasma spiked with GA-Me(2)and nandrolone phenylpropionate(1)(b)，and of plasma sample from a subject 1 min after intravenous administration(c).

2.8.3 血液樣品的處理 將血樣置于涂有肝素鈉的離心管中，12 000×g離心3 min，取上層血漿250 μL(口服時取500 μL)，加入內標及藥物溶液共50 μL，內標終質量濃度為10 μg/mL，添加乙腈 1 mL，渦旋2 min，7 000 r/min離心20 min后精密量取上層0.9 mL(口服時1.2 mL)于另一只試管中，40 ℃氮氣吹干，流動相200 μL溶解，取20 μL注入高效液相色譜儀記錄色譜圖。根據峰位判斷，保留時間在9 min左右的色譜峰為GA-Me的色譜峰，保留時間在7 min左右的色譜峰為內標物的色譜峰。結果表明，血漿內原性物質不干擾測定，內標與藥物色譜峰分離度符合測定要求，峰形對稱。

2.8.4 標準曲線和靈敏度 精密量取適量GA-Me及內標溶液共50 μL 至250 μL(口服時取500 μL)血漿中，使 GA-Me 質量濃度分別為 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 μg/mL，內標終質量濃度為 10 μg/mL，按 2.8.3 項操作，測定標準曲線。以GA-Me質量濃度為橫坐標，GA-Me與內標峰面積比值為縱坐標，經線性回歸得靜脈給藥標準曲線為:y=0.042 4x+0.012 1(r=0.999 6)，口服給藥標準曲線為:y=0.126x+0.001 8(r=0.998 5)。結果表明 GA-Me質量濃度在0.05 ～51.2 μg/mL范圍內線性關系良好，最低檢測限為0.05 μg/mL。

2.8.5 方法回收率與精密度 取空白血漿分別加入 GA-Me及內標溶液，使 GA-Me成 0.05、0.2、40 μg/mL各質量濃度，內標終質量濃度為10 μg/mL，按2.8.3項操作后進樣，記錄色譜圖。3種質量濃度的平均回收率分別為 96.7%、99.4%、99.2%。連續測定5日。日內、日間RSD均小于8.8%，符合生物樣本測定方法的要求。

2.8.6 穩定性 取空白血漿分別加入GA-Me及內標溶液，使 GA-Me 成0.05、0.2、40 μg/mL 各質量濃度，內標終質量濃度為10 μg/mL，置于4℃保存10 min和12 h，－20 ℃保存12 h后，按 2.8.3項操作后進樣，記錄色譜圖。結果表明10 min內樣品保持穩定，回收率大于97%，12 h后樣品回收率小于75%，建議盡快處理血液樣品，藥物在10 min內轉移到有機相中可以保證實驗結果的準確性。

2.8.7 藥動學參數 分別對9只兔(體質量為2.3～2.7 kg)靜脈注射(GA-Me，1.5 mg/kg)和口服(GA-Me，7 mg/kg或一粒腸溶膠囊，含 GA-Me 20mg)給藥，分別在 0、1、3、5、10、15、30、60、120、180、240、360、480、1 440 min(靜脈注射)和 0、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480、1 440 min(口服給藥)從耳緣靜脈取血，按照2.8.3項血液樣品處理方法，采用HPLC方法測定GA-Me濃度，以不同時間測得的血漿中GA-Me量的平均值對時間t作圖，得兩種給藥途徑下GA-Me的血藥濃度-時間曲線。用kinetica 4.4藥物動力學程序處理數據(見表1)，結果表明口服GA-Me符合三室模型，GA-Me靜脈注射與口服GA-Me-β-CD包合物腸溶膠囊符合二室隔室模型。

表1 靜脈注射GA-Me(1.5 mg/kg)和口服GA-Me、腸溶膠囊(7 mg/kg)藥動學參數(±s，n=3)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of GA-Me in rabbit plasma following a single dose of intravenous administration(1.5 mg/kg)，oral administration of GA-Me(7 mg/kg)or enteric-coated capsules of GA-Me-β-CD inclusion complex(7 mg/kg).Data were presented as ± s(n=3)

表1 靜脈注射GA-Me(1.5 mg/kg)和口服GA-Me、腸溶膠囊(7 mg/kg)藥動學參數(±s，n=3)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of GA-Me in rabbit plasma following a single dose of intravenous administration(1.5 mg/kg)，oral administration of GA-Me(7 mg/kg)or enteric-coated capsules of GA-Me-β-CD inclusion complex(7 mg/kg).Data were presented as ± s(n=3)

參數 單位 靜脈注射0.39 ±0.07 0.59 ±0.09 tmax min — 49.45 ±8.91 131.45 ±3.48 AUC0-24 h μg·min/mL 237.08 ±8.25 240.04 ±8.31 308.98 ±53.60 t1/2α min 2.88 ±0.36 4.06 ±1.02 79.28 ±5.04 t1/2β min 57.96 ±6.94 50.61 ±8.20 787.45 ±349.57 t1/2γ min — 5 148.40 ±909.95 —Vc L/kg 0.08 ±0.02 2.42 ±0.65 4.91 ±0.92 CL mL/(kg/min) 6.34 ±0.02 6.60 ±1.28 23.30 ±3.70 F%—腸溶膠囊Cmax μg/mL —口服給藥GA-Me 21.70 ±0.75 27.93 ±4.84

3 討論

包合物的制備方法有飽和水溶液法、超聲法、研磨法及冷凍干燥法等［9］。本實驗根據GA-Me的理化性質，采用研磨法制備GA-Me-β-CD包合物，提高了GA-Me在水中溶解度。為進一步避免胃液對藥物的分解作用，將GA-Me-β-CD包合物與適量輔料混合后直接填裝腸溶膠囊，該膠囊溶出度、含量測定、穩定性等評價項目均符合藥典要求。單次服用GA-Me-β-CD包合物腸溶膠囊，與GA-Me原藥口服給藥相比，口服生物利用度有增大的趨勢，但沒有顯著增加，GA-Me在酸性條件下含量迅速下降，可能是由于GA-Me大量析出與少量分解所致。制成GA-Me-β-CD包合物腸溶膠囊，改善了GA-Me的口服生物利用度［10］。本研究為靈芝酸的臨床前研究提供了實驗數據。

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