松蘿酸自微乳和滴丸在大鼠體內的藥物動力學研究

趙 穎， 宋 丹， 陶建生， 張 彤， 王昌華

(1.重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054;2.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203;3.重慶市中藥研究院，重慶 400065)

松蘿酸是目前最重要的也是分布最廣的地衣酸之一，具有抗腫瘤［1］、殺蟲、抗病毒［2］、抗炎、抗菌［3-4］、促進皮膚創傷愈合［5］等作用，松蘿酸的藥理活性較強，開發新藥具有一定的價值，但松蘿酸為難溶性藥物，溶解度和溶出度較差，體內生物利用度不高。目前對松蘿酸的新劑型及藥動學方面的研究較少，本實驗制備了松蘿酸自微乳(Usnic Acid Self-microemulsify Drug Delivery System，UASMEDDS)和滴丸劑(Usnic acid Dropping pills)，以兩種制劑為研究對象，建立大鼠血漿中松蘿酸的HPLC測定方法，以松蘿酸混懸液為參比制劑，考察了松蘿酸兩種制劑口服給藥后大鼠體內藥動學過程。

1 材料

1.1 藥品和試劑 松蘿酸(usnic acid)對照品(由重慶市中藥研究院藥化室宋丹副研究員提供，經HPLC定量測定純度≥99%);松蘿酸原料藥(從地茶科地茶屬植物雪地茶Thamnolia subuliformis(Ehrh.)W.Culb.中分離制備，批號 20080325，含量≥98%);松蘿酸自微乳(自制，批號20081225);松蘿酸滴丸(自制，批號20081211);松蘿酸混懸液(自制，以1%CMC-Na為溶劑)。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，蒸餾水為重蒸水。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，體質量220～240 g，由重慶市中藥研究院動物室提供，合格證號:SCXK(渝)20020004號。

1.3 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀;紫外檢測器;SB2200超聲清洗機(SHANGHAI BRANSON);AUW-220D電子天平(日本島津);XW-80A型漩渦混合器(上海醫科大學儀器廠);TGL-16C離心機(上海安亭科學儀器廠)。

2 松蘿酸自微乳和滴丸的制備

2.1 松蘿酸自微乳的制備 用 Maisine35-l、Labrafac Lipophile WL 1349作為混合油相，Cremophor RH40作為表面活性劑，Transcutol P作為助表面活性劑制備自微乳。精密稱取處方量的混合油相、表面活性劑和助表面活性劑置于具塞三角錐形瓶中，50℃水浴中混勻后，稱取松蘿酸原料藥加入到三角錐形瓶中，置于37℃水浴中緩慢震蕩，直至藥物溶解形成透明、均一溶液，得松蘿酸自微乳。

2.2 松蘿酸滴丸的制備 將基質PEG 4000置水浴上加熱熔化，熔化后將藥物按規定的比例加入基質中，不斷攪拌加熱，控制溫度，混合均勻，保持一定溫度，置滴丸機貯液罐中。調節滴速30滴/min滴入冷凝液中，冷凝成丸。收集滴丸，吸除附于滴丸的冷凝劑，干燥即得。

3 方法

3.1 色譜條件［6］SepaxSapphire C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 ∶(50 mmol KH2PO4∶三乙胺500∶1)(70∶30);柱溫:40℃;體積流量:0.8 mL/min;檢測波長:285 nm。

3.2 標準溶液的配制 精密稱取松蘿酸對照品適量，加少量三氯甲烷溶解后用甲醇稀釋制成200.00 μg/mL的貯備溶液，備用。

3.3 血漿樣品處理 取血漿樣品200 μL，加入200 μL磷酸鹽緩沖液渦旋混勻振蕩提取30 s，加入600 μL甲醇旋渦混勻1 min，靜置5 min，10 000 r/min離心15 min，轉移上層清液于離心管中，過0.45 μm微孔濾膜，取濾過上清液20 μL進樣分析。

3.4 給藥方案與樣品采集 取SD大鼠，隨機分組，每組6只。給藥前禁食12 h，自由飲水。以24 mg/kg的劑量分別灌胃給予松蘿酸各種制劑。松蘿酸混懸液組分別于給藥前及給藥后 1、2、4、8、12、24、36、48 h尾靜脈取血0.5 mL;松蘿酸滴丸組分別于給藥前及給藥后 0.5、1、2、4、8、12、24、48 h 尾靜脈取血0.5 mL;松蘿酸自微乳組分別于給藥前及給藥后 20，40 min，1、2、4、8、12、24 h 尾靜脈取血 0.5 mL，全血置于涂有EDTA的抗凝管中，3 000 r/min離心10 min分離血漿，－20℃保存至分析測定。測定前按3.3項血漿樣品處理方法處理，HPLC測定松蘿酸。

3.5 數據處理 血藥濃度數據由中國藥學會藥理學委員會編制的3P97藥動學程序進行處理。

圖1 血漿中松蘿酸HPLC色譜圖A.松蘿酸標準品 B.空白血漿 C.空白血漿+松蘿酸 D.樣品Fig.1 Chromatograms of usnic acid in rat plasmaA.usnic acid B.blank plasma sample C.blank plasma and usnic acid D.sample

4 結果

4.1 方法專屬性 在本實驗所采用的色譜條件下，測得松蘿酸標準品溶液、大鼠空白血漿、空白血漿加一定濃度松蘿酸溶液及給藥后血漿樣品的HPLC色譜圖見圖1。結果表明，在上述色譜條件下，松蘿酸與血漿內源性物質分離情況良好，無雜質峰干擾。

4.2 標準曲線及線性關系 取大鼠空白血漿7份，每份150 μL，精密加入稀釋成不同倍數的松蘿酸貯備溶液50 μL，配制成最終質量濃度分別為0.025、0.25、2.5、6.25、12.5、25、50 μg/mL 的標準含藥血漿，按3.3項血漿樣品處理方法處理，計算松蘿酸的峰面積，用藥物質量濃度 C與峰面積比作線性回歸，得血漿中松蘿酸含量標準曲線。回歸方程為Y=55 473X+4 878.2，r=0.999 3，血漿中松蘿酸在0.025～50 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。按色譜條件測得松蘿酸在大鼠血漿中的最低檢測限為0.005 μg/mL。

4.3 方法精密度試驗 取大鼠空白血漿和松蘿酸標準貯備溶液，配制成最終質量濃度分別為0.025、6.25、25 μg/mL，各5 份。按3.3 項血漿樣品處理方法操作，于一日內連續進行HPLC測定，并計算得日內差;連續測定5 d，計算得日間差。低、中、高濃度的日內精密度 RSD 分別為5.05%、2.23%、4.12%;5 d的日間精密度 RSD分別為6.25%、3.05%、5.27%。表明該方法重現性、重復性良好，符合生物樣品定量測定要求。

4.4 方法回收率 大鼠尾靜脈取血0.4 mL，全血置于涂有EDTA的抗凝管中，精密加入稀釋成不同倍數的松蘿酸貯備溶液100 μL，配制成最終質量濃度為 0.025、6.25、25 μg/mL 含松蘿酸血液樣品，3 000 r/min離心10 min分離血漿，取含藥大鼠血漿200 μL，按3.3項血漿樣品處理方法處理，在上述色譜條件下，每一濃度平行操作5次，求得實測濃度，計算方法回收率。結果表明，低、中、高各濃度的平均回收率分別為 98.57%、98.38%、93.46%，RSD分別為 10.10%、7.31%、6.61%。

4.5 松蘿酸制劑口服給藥后大鼠體內藥動學研究

按3.4項下操作，大鼠灌胃給予松蘿酸混懸液、松蘿酸滴丸和松蘿酸自微乳后，測定松蘿酸各制劑對應時間點血漿中松蘿酸峰面積，并根據回歸方程計算血藥濃度，松蘿酸在大鼠體內的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

結果表明，各制劑組的達峰濃度均顯著高于參比制劑松蘿酸混懸液，松蘿酸滴丸的達峰濃度最大，松蘿酸自微乳和滴丸的藥-時曲線下面積明顯大于混懸液。

4.6 松蘿酸各制劑組藥動學參數的比較 采用3P97藥動學程序處理松蘿酸混懸液和各制劑組平均血藥濃度數據，根據AIC值最小法和WSS綜合判斷各組隔室模型。結果表明，松蘿酸混懸液和各制劑組在大鼠體內給藥后均符合單室一級吸收模型，權重系數為1/C2。各制劑組主要藥動學參數見表1。

圖2 松蘿酸各組制劑的平均血藥濃度-時間曲線Fig.2 Mean plasma concentration-time cuvres of usnic acid in rats after oral administration different formulations of usnic acid(n=6)

表1 松蘿酸各種制劑主要藥動學參數Tab.1 Pharmacokinetic parameters for usnic acid in rats after oral administration different formulations of usnic acid

5 討論

5.1 由全血制備血漿時，離心速度過高，血細胞易破裂而使血漿帶紅色，因此離心速度一般控制在3 000 r/min為宜。血漿樣品處理方法和已有文獻報道方法相比［7］操作簡單，藥物提取率高，方法回收率好。

5.2 在測定生物樣本時，需要建立適合的體內定量測定方法，并要求方法具有專屬性、準確度、靈敏度。本實驗建立了松蘿酸動物體內血漿樣品的高效液相色譜分析方法，進行方法學驗證，主要考察了方法的專屬性、標準曲線的制備與線性范圍、精密度和方法回收率，均達到生物樣品分析的要求，制定的分析方法專屬性、準確度和靈敏度均較好。在此色譜條件下，松蘿酸分離度良好，無干擾。

5.3 大鼠分別以24 mg/kg的劑量灌胃給予松蘿酸混懸液、松蘿酸自微乳和松蘿酸滴丸后，Tmax分別為2.350 h、2.968 h 和3.125 h;Cmax分別為12.431 μg/mL、36.860 μg/mL 和42.392 μg/mL;AUC0-∝分別為129.783 μg/(mL·h)、660.934 μg/(mL·h)和646.777 μg/(mL·h)。比較松蘿酸各制劑的藥動學參數可以看出，各組吸收速度常數差異不大;消除速度常數混懸液組 ＞滴丸組 ＞自微乳組(P＜0.05);松蘿酸滴丸和松蘿酸自微乳的達峰時間(Tmax)和混懸液劑差異不大，峰濃度(Cmax)均顯著高于混懸液劑(P＜0.05)，兩種制劑的藥-時曲線下面積(AUC)明顯大于混懸液劑(P＜0.05)，松蘿酸自微乳和松蘿酸滴丸的消除半衰期t1/2(ke)明顯延長。和參比制劑松蘿酸混懸液比較，松蘿酸自微乳與松蘿酸滴丸的相對生物利用度分別為509.3%、498.4%，兩種制劑的相對生物利用度均顯著提高。

建立了松蘿酸血漿樣品高效液相色譜分析方法，血漿樣品穩定性、方法精密度、方法回收率符合要求。藥動學數據結果表明，對照組和各制劑組在大鼠體內給藥后均符合單室一級吸收模型。和參比制劑松蘿酸混懸液比較，松蘿酸自微乳與滴丸兩種制劑的相對生物利用度均顯著提高。將難溶性藥物松蘿酸通過制劑增溶技術制備成松蘿酸自微乳和滴丸兩種藥物新型給藥系統后，其體內生物利用度得到顯著提高，劑型設計達到了預期目的。本實驗可為開發松蘿酸兩種制劑提供體內藥物動力學參考。

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［2］Campanella L，Delfini M，Ercole P，et al.Molecular characterization and action of usnic acid:a drug that inhibits proliferation of mouse polyomavirusin vitroand whose main target is RNA transcription［J］.Biochimie，2004，84(4):329-334.

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［5］靳菊情，董亞琳，賀浪沖.松蘿酸鈉促皮膚創傷愈合的實驗研究［J］.中藥材，2005，28(2):109-111.

［6］趙 穎，宋 丹，鐘國躍，等.HPLC法測定雪地茶中松蘿酸［J］.中草藥，2009，40(增刊):281-282.

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