星點設計-效應面法優化白芷的超聲波輔助提取工藝

董自亮， 肖 丹， 何 健， 梅 雪

(成都中醫藥大學藥學院，四川成都 611137)

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)shan et Yuan的干燥根。其性溫，氣芳香，味辛、微苦，具有散風除濕、通竅止痛、消腫排膿的作用，被臨床廣泛應用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶和瘡瘍腫痛等癥，并有較好的療效［1］。白芷中總香豆素類為其鎮痛的主要成分，又以歐前胡素、異歐前胡素和氧化前胡素為其主要成分，其止痛效果已被充分肯定［2］。

目前國內多采取正交設計優化藥材的提取工藝，這種方法采用線性數學模型，雖有簡便、實驗次數少等優點，但精度不太高。星點設計(central composite design，CCD)［3-5］是近幾年來國外藥學工作者常用的集數學和統計方法于一體的實驗設計方法，多采用非線性數學模型擬合，復相關系數高，應用已經成熟，具有精度高、預測性好、簡便等優點。近年國內也有其用于優化處方或成型工藝的報道［6-9］。本實驗引入星點實驗設計-效應面法優選白芷的提取工藝，旨在優化白芷提取工藝的同時，為探討該實驗設計法應用于優化傳統中藥提取工藝可行性提供依據。

1 儀器與試藥

KQ-300E型超聲波清洗器(超聲頻率:40 KHz;超聲功率:300 W;昆山市超聲儀器有限公司);島津LC-2010 AHT型高效液相色譜儀，島津Class vp色譜工作站;電子天平(BP-211D，Sartorius，德國)。

白芷藥材于2009年3月采自四川遂寧，經成都中醫藥大學馬逾英教授鑒定為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f的干燥根，符合《中國藥典》2010版一部白芷項下的有關規定，陰干，粉碎，備用;歐前胡素對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:110826-200712);所用水為純蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 歐前胡素定量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為 Dikama C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);檢測波長:300 nm;流動相:甲醇-水(70∶30);體積流量:1 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:10 μL;理論塔板數按歐前胡素峰計算應不低于3 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對照品5.15 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取白芷提取液5 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，進樣前經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 標準曲線的繪制 分別精密吸取10 μL不同質量濃度(5.150、7.725、10.300、12.875、15.450、18.025 μg/mL)的對照品溶液，按上述色譜條件測定，以峰面積與質量濃度進行線性擬合，得線性方程為Y=49 068X－1 443.3，(r=0.999 9，n=6)。結果表明，歐前胡素對照品溶液在5.150 ～18.025 μg/mL的質量濃度范圍內具有良好的線性關系。

2.1.5 精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續進樣6次，按上述色譜條件測定，結果歐前胡素峰面積的RSD為1.70%。

2.1.6 穩定性實驗 精密稱取同一對照品溶液，分別在 0、2、4、6、8 h 測定，按上述色譜條件測定，得出RSD為1.62%，表明被測物在8 h內基本穩定。

2.1.7 重復性實驗 同一批號白芷藥材按照2.1.3項下方法平行制備5份，測定RSD為1.91%，表明方法的重復性良好。

2.1.8 加樣回收實驗 分別精密稱取同一白芷藥材粉末約0.2 g(約含有歐前胡素0.42 mg)9份，分成高、中、低3組，精密加入對照品適量，按照2.1.3項下平行制備供試品溶液，計算得平均回收率為101.86%，RSD 為 2.35%。

2.1.9 藥材含量測定 取白芷樣品，平行制備3份供試品，分別吸取10 μL進行測定，計算得白芷藥材中歐前胡素的質量分數為0.21%(n=3)，色譜圖見圖1。

圖1 歐前胡素對照品(A)與白芷提取液(B)的HPLC圖

2.2 星點設計試驗 白芷超聲提取工藝的考察因素為乙醇濃度、料液比、超聲時間、功率等，結合預實驗結果和工業生產的實際，暫定超聲功率為300 W，其余因素的水平據預實驗的結果而定。因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 星點設計因素與水平

2.3 模型擬合 以白芷歐前胡素的提取率為因變量對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合，使用SAS 9.0統計軟件，擬合模型如下:

表2 星點試驗設計與結果

多元線性回歸:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3，

多元線性回歸:r=0.900 8，F=15.78，P=0.000 3＜0.01，盡管模型通過檢驗，但擬合度不佳，預測性較差，因此線性模型不合適。故對其二項式進行擬合，對各項系數進行t檢驗，刪除P＞0.05的項，以達到簡化模型的目的，結果見表3。

模型的復相關系數r=0.988 6，先刪除最不可信的b7項，重新擬合，再根據P值依次刪除b8、b5項，再擬合，結果見表4。

復相關系數r=0.973 8，相對于線性擬合有大幅提高，方程簡化后r值降幅很小，表明該方程有較大的可信度。

表3 二項式非線性估計結果

表4 簡化后二項式非線性估計結果

2.4 工藝優化和預測 因變量曲面圖是三維圖，只能表達含兩個自變量的函數，因此固定三個自變量之一為中值，以擬合的目標函數為數學模型，應用Origin 7.5軟件繪制因變量曲面圖(見圖2～4)，在圖上選取提取率高的較佳工藝范圍:X1:70%～80%;X2:65～75 min;X3:12～14倍;結合工業生產，故本實驗選取白芷超聲提取的最佳工藝為12倍量、75%乙醇提取70 min。

圖2 乙醇質量濃度和提取時間對指標值歐前胡素的效應面圖

圖3 乙醇質量濃度和料液比對指標值歐前胡素的效應面圖

圖4 提取時間和料液比對指標值歐前胡素的效應面圖

根據較佳工藝條件重復試驗3次，結果與擬合方程預測值相比較，偏差為2.16%，見表5。

表5 驗證實驗結果

3 討論

國內關于白芷超聲提取工藝的文獻少有報道，作者以歐前胡素為考察指標，優化了白芷超聲提取工藝，同時改進了2010年版《中國藥典》中白芷含量測定的色譜條件，結果表明本HPLC結果準確，靈敏度高、重現性好。

本課題組也對影響正交試驗的因素乙醇濃度、料液比以及提取時間不同水平進行了正交試驗優化，得到的正交設計的結果是加入14倍量的75%乙醇，提取75 min，3次驗證后可得平均提取率為88.64%。由兩者優化的結果可知:所用的乙醇濃度相等，兩者的提取率無顯著性差異，但是星點設計中溶劑用量較正交設計少，所用提取時間短于正交設計，考查因素的水平范圍更大，最優工藝的選擇不僅限于所設置的水平;由試驗結果可知，星點設計的理論優化結果與試驗值相差不大，由此可以看出采用非線性模型，更接近客觀實際和便于找到極值范圍，水平的選取更為直觀，實驗精度更高，預測性更好。

提取次數是影響白芷提取工藝的因素之一，由于提取次數為不連續變量，故前期未對提取次數進行考察。后期經過進一步試驗考察與驗證，按本工藝條件對白芷藥材進行超聲提取2次后，歐前胡素已基本提取完全，故確定最佳優化工藝為:以12倍量、75%乙醇超聲提取2次，每次70 min。

致謝:研究得到通威股份有限公司藥物研究所的幫助。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:98.

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［5］吳 偉，崔光華.星點設計-效應面優化法及其在藥學中的應用［J］.國外醫學藥學分冊，2000，27(5):292-298.

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