基于微量量熱法表征的茵梔黃注射液質量波動評價方法研究

張 萍， 任永申， 鄢 丹， 段慧娟， 李正明， 肖小河*

(1.解放軍中藥研究所解放軍第三0二醫院，北京 100039;2.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 610075;3.軍醫進修學院研究生隊，北京 100853)

中藥注射劑是我國傳統醫學理論與現代科學結 合的產物，它開辟了中藥新的給藥途徑，提高了中藥治療臨床急重癥的療效，成為中藥現代化成果的代表，其中諸如清開靈注射液、茵梔黃注射液等都以優良的療效成為臨床常用品種，并成為醫院藥品采購的重點。近年來，關于中藥注射劑不良反應的事件和報道卻不斷攀升，給中藥注射劑的進一步研發和應用蒙上了一層陰影。2008年報道的茵梔黃注射液嚴重不良反應事件，直接導致了該批號注射液的停用，在業內引起了強烈的反響，促發了人們對中藥注射劑的質量問題和合理用藥的新認識。

茵梔黃注射液是由茵陳、梔子、金銀花、黃芩等藥物組成的中藥復方制劑，具有清熱、解毒、抗菌、消炎及增強機體免疫功能等藥理作用，常用于治療肝膽濕熱、小便黃赤、急慢性肝炎等病癥［1］，其臨床應用廣泛且療效顯著［2-3］。然而，其不良反映的發生已給人們以警示:有必要對該注射液安全性和穩定性進行客觀真實的評價。

為進一步提高茵梔黃注射液的臨床應用價值，我們從質量一致性和穩定性出發，針對該注射液的抗菌作用，采用微量量熱法［4-6］考察了7批石家莊神威藥業生產的茵梔黃注射液對金黃色葡萄球菌生長代謝的影響，以細菌的生長代謝曲線和定量熱動力學參數為指標，結合主成分分析和聚類分析，比較和分析了7批注射液的抗菌作用和質量差異，為該注射液安全性和穩定性評價提供了方法和模式參考。

1 儀器與方法

1.1 儀器 采用瑞典Thermometric公司產的3114/3236型TAM Air Isothermal Calorimeter微量量熱儀測定金黃色葡萄球菌的生長熱譜曲線。該熱活性檢測儀配置Pico TC-80數據采集和分析軟件，可同時獨立測定8個樣品。其熱穩定性好，熱功率檢測限低，且基線穩定。其它有關儀器結構原理及操作詳見文獻［7］。

1.2 材料 菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)CMCC(B)26 003，由中國藥品生物制品檢定所提供。培養基:LB液體培養基，取NaCl 10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，溶解于1 000 mL去離子水中，調pH7.0～7.2后分裝。121℃高壓蒸氣滅菌30 min，冷卻后置4℃冰箱中保存備用。

1.3 樣品 石家莊神威藥業(SW)生產的茵梔黃注射液合格樣品共7批，其生產批號及規格詳見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information of Yinzhihuang Injection

1.4 方法 采用安瓿法，在無菌條件下，向參比池各20 mL安瓿瓶內分別加入10 mL已滅菌去離子水作為參比。反應池各安瓿瓶中精確加入10 mL LB培養基(其中已接種1.0×106CFU/mL的金黃色葡萄球菌)，然后分別加入100 μL(1%，v/v)各批茵梔黃注射液，加蓋瓶塞密封，放入微量量熱儀中跟蹤記錄金黃色葡萄球菌生長代謝熱譜曲線(Power-time，P-t曲線)，系統控溫于37℃，上述均為無菌操作。當曲線重新返回基線時，實驗結束。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌的生長熱功率輸出曲線

37℃下，安瓿法測定了100 μL(1%，v/v)各批次茵梔黃注射液作用下金黃色葡萄球菌的生長代謝曲線，見圖1。

圖1 茵梔黃注射液樣品作用于金黃色葡萄球菌的熱功率-時間曲線Fig.1 The power-time curve of S.aureus affected by Yinzhihuang Injection

結合Kong等［8］報道，金黃色葡萄球菌的生長代謝曲線可以劃分為5個生長期:停滯期、第一指數生長期、過渡期、第二指數生長期和衰亡期。分別對應于細菌對培養基中不同營養成分的利用情況及不同的代謝過程。從圖中曲線的兩個最高峰的出峰時間和高度可以看出，不同批次的茵梔黃注射液對金黃色葡萄球菌的生長代謝有不同的影響，這也提示我們，采用該方法研究各批次注射液對該細菌的影響以評價茵梔黃注射液的抗菌作用有一定的合理性。

2.2 金黃色葡萄球菌生長代謝的熱動力學參數在細菌細胞的生長過程中，其指數生長期內的產熱功率與培養時間之間符合公式［9］:Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0+kt。

其中，P0，Pt分別是細菌在指數生長的起始點和t時刻的熱輸出功率。將lnP和t進行線性擬合可以得到金黃色葡萄球菌指數生長期的生長速率常數k;對各曲線下面積進行積分可以得到細菌生長過程中的產熱量Q，見表2。其中k1和k2、P1和P2、t1和t2分別為第一和第二指數生長期的生長數率常數、兩個最高峰的輸出功率和出峰時間。

圖2的柱狀圖更直觀和快速地呈現了各批次注射液作用下金黃色葡萄球菌生長代謝熱動力學參數的變化情況。

表2 茵梔黃注射液作用的金黃色葡萄球菌生長熱動力學參數Tab.2 The thermokinetics parameters of S.aureus affected by Yinzhihuang Injection

圖2 7批茵梔黃注射液樣品作用于金黃色葡萄球菌的生物熱動力學參數柱狀分析圖Fig.2 The chart for the thermokinetics parameters of S.aureus affected by Yinzhihuang Injection

圖2顯示，相對于空白對照(不加注射液)組，各批次注射液作用下金黃色葡萄球菌生長代謝曲線的最高峰出峰時間變化不明顯，而生長速率常數、最大輸出功率和總產熱量變化顯著，但是變化規律不一致，難以準確分析和比較注射液的抗菌作用。為此，我們引入主成分分析和聚類分析的分析方法，客觀有效地評價不同批次注射液的抗菌作用規律和內在質量的一致性和穩定性。

2.3 主成分分析 主成分分析［10-12］是用于研究試驗考察因素與多個變量間關系的一種多元統計學方法，其采用主成分分析思想，將多元變量壓縮為2個對全數據集貢獻度大致相等的主成分變量Z1和Z2，然后根據標準化表達式計算出各數據點的主成分變量集［Z1，Z2］，再將各數據組的主成分均值繪在坐標系上實現二維空間投影，從而直觀表達出試驗考察因素的內在變化規律。本文采用SAS統計軟件［10］對表2中數據進行主成分分析，結果表明Z1和Z2分別可解釋原來7個變量(定量熱動力學參數52.5%和24.75%的信息，累積解釋77.25%的原信息，提示構建的2個主成分可較好的表達原來7個熱動力學參數反應的各批次注射液的抗菌作用。2個主成分的表達式分別為:

上式中熱動力學參數前系數的絕對值表示該參數對主成分的貢獻大小，正負符號表示影響方向。由熱動力學參數對兩個主成分的共同貢獻率可以看出，分析第一指數生長期的生長速率常數k1和整個生長過程的產熱量Q的數值變化，可以較快地評價7批注射液的抗菌作用差異:相對于空白對照(不加藥液)組，7批注射液均有抗金黃色葡萄球菌的作用，且其作用強度為，S5＞S7＞S3＞S6＞S4＞S2＞S1。為了能更直觀地反映這一規律，本文以空白對照組為坐標原點將主成分坐標系進行了平移做出了前兩個主成分的二維投影圖，見圖3(圖中用不同圖例符號用以區分各批次樣品)。從圖中可以看出:以正常組為中心，各批次樣品與正常組的距離不同。各樣品距離遠點的距離遠大，其抗菌作用越強。圖3也更直觀表明7批注射液的抗菌的作用強度為:S5＞S7＞S3≥S6＞S4＞S2＞S1。

圖3 7批茵梔黃注射液抗菌活性分布圖Fig.3 The antibacterial activity profile of 7 batches of Yinzhihuang Injection

2.4 聚類分析 上述的分析結果表明了7批次注射液的抗菌作用差異和程度強弱，但是，卻未能反映出此7批注射液內在質量的一致性和穩定性。為此，我們引入了聚類分析的分析方法。以表2中熱動力學參數值為指標，采用SPSS 13.0軟件對7批注射液進行聚類分析，結果見圖4。

結果顯示，7批樣品首先被分為兩大類，S5單獨成類，為2007年1月生產的某批產品，結合主成分分析結果可以得出，此樣品的抗菌作用最強，且質量最穩定，其余6批樣品聚為一類，表明其內在質量有一定的相似性，但是沒有S5樣品穩定。進一步分析表明，此6批樣品又可被分為兩類，其中S1單獨成類，為2006年6月生產的某批產品，結合主成分分析結果可以得出，此樣品的抗菌作用最弱，但質量較穩定;其余5批樣品的抗菌作用和內在穩定性較為相似。

圖4 7批茵梔黃注射液樣品聚類分析圖Fig.4 The cluster analysis of 7 batches of Yinzhihuang Injection

3 討論

微量量熱法是基于生化反應中普遍存在的熱交換而建立的，它能在不干擾生物體系的正?；顒雍痛x的情況下，直接監測生物體系代謝過程中的熱效應，實時、在線、動態、量化地獲得微生物生長代謝過程中的整體信息，從而反映其他物質對該微生物的干預作用和藥效強弱，從而有效地彌補了常規方法信息單一的不足［13］。

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌的典型代表，在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到，是自然界的優勢菌群。其營養要求不高，在普通培養基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37℃，最適生長pH 7.4，適用于生物熱動力學研究及其它藥物的抗菌作用評價。任永申等［14-15］采用微量量熱法分析和比較了多種微生物的生長代謝情況，結果表明，金黃色葡萄球菌的生長周期相對較短，能夠更快速的實現對樣品的檢測，故本研究選用該細菌為生物模型評價茵梔黃注射液的抗菌作用。

微量量熱法記錄的茵梔黃注射液作用下金黃色葡萄球菌的生長代謝曲線和熱動力學參數的變化，直觀、快速地反映了7批次注射液對該細菌的影響;主成分分析結果顯示第一指數生長期的生長速率常數k1和整個生長過程的產熱量Q的數值，可以反應各批注射液的抗菌作用差異，且其抑菌作用強度順序為，S5＞S7＞S3＞S6＞S4＞S2＞S1。聚類分析結果表明，抗菌作用最強的S5樣品的內在質量最穩定，強于S7和S6樣品;抗菌作用最弱的S1樣品的內在質量最不穩定，弱于S2和S3樣品。以上結果綜合表明，茵梔黃注射液雖然同為同一藥廠的產品，但是生產時間、生產批次等因素對產品的抗菌作用和內在質量和穩定性存在一定的影響。為此，筆者建議，針對注射液的不良反應和事件頻發的情況，藥廠在生產產品應嚴格控制生產過程、生產環節及其相關因素，且產品在出廠時應嚴格檢查，確保安全。

本實驗采用微量量熱法，以金黃色葡萄球菌為模式生物，細菌的生長代謝曲線和定量熱動力學參數為指標，結合統計學分析，比較7批茵梔黃注射液的抗菌作用和內在質量差異，為該注射液的質量一致性和穩定性評價提供了方法和模式參考，有望為中藥注射劑的安全使用提供技術指導。

［1］任永申，張 萍，杜曉曦，等.基于HPLC指紋圖譜的茵梔黃注射液質量一致性和穩定性研究［J］.中草藥，2008，39(6):837-841.

［2］陳輝揚，陳 軍，溫平康.茵梔黃注射液的藥理作用與臨床應用評價［J］.藥品評價，2005，2(2):122-124.

［3］陳輝揚，陳 軍，吳泰相，等.茵梔黃注射液治療黃疸型病毒性肝炎臨床研究的方法學質量評價［J］.中國藥房，2005，16(13):1031-1033

［4］Kong W J，Zhao Y L，Shan L M，et al.Investigation on the spectrum-effect relationships of EtOAc extract fromRadix Isatidisbased on HPLC fingerprints and microcalorimetry［J］.J Chroma-togrB，2008，871:109-114.

［5］武彥舒，張 倩，金 城，等.清開靈注射液生物熱活性指紋圖譜的初步研究［J］.中國藥學雜志，2009，44(6):471-474.

［6］張雅銘，鄢 丹，張 萍，等.基于化學指紋圖譜-生物熱活性圖譜關聯檢測的注射用雙黃連凍干粉針質量控制方法的初步研究［J］.藥學學報，2010，45(1):93-97

［7］Wadso I.Microcalorimetric techniques for characterization of living cellular systems-Will there be any important practical application［J］.Thermochim Acta，1995，269-270:337-350.

［8］KongW J，Jin C，Xiao X H，et al.Comparative study of effects of two bile acid derivatives onStaphylococcus aureusby multiple analytical methods［J］.J Hazard Mater，2010，179(1-3):742-747.

［9］Xie C L，Tang H K，Song Z H，et al.Microcalorimetric study of bacterial growth［J］.Thermochim Acta，1988，123:33-41.

［10］胡良平.Windows SAS 6.12＆8.0 實用統計分析教程［M］.北京:軍事醫學科學出版社，2001.

［11］王伽伯，馬永剛，金 城，等.對應分析在大黃炮制減毒“量-毒”規律研究中的應用［J］.中國中藥雜志，2009，34(19):2498-2502.

［12］Kong W J，Wang J B，Jin C，et al.Effect of emodin on Candida albicans growth investigated by microcalorimetry combined with chemometric analysis［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，83:1183-1190.

［13］任永申，鄢 丹，張 萍，等.基于微量量熱法測定的板藍根紅細胞凝集活性研究［J］.藥學學報，2010，45(8):1028-1034.

［14］任永申.基于化學-生物指紋圖譜分析的中藥注射劑不良反應早期快速篩查方法研究［D］.成都中醫藥大學，2008.

［15］任永申，張 萍，鄢 丹，等.茵梔黃注射液對體外CCl4致肝細胞損傷的保護作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16(18):115-121.