基于RSM法優化補骨脂中總呋喃香豆素的提取工藝

陳 京， 姜春波， 熊耀康

(浙江中醫藥大學，浙江杭州 310053)

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實，味辛，苦，歸腎、脾經，具有補腎壯陽、納氣、溫脾止瀉之功效。補骨脂的化學成分主要是香豆素類、黃酮類和單萜類化合物，其香豆素類具有抗腫瘤［1］、抗抑郁［2］、平喘［3］、防治骨質疏松［4］等作用，其中呋喃香豆素類為補骨脂的主要活性物質［5］，由于補骨脂中呋喃香豆素類成分無酚羥基，而其他成分有酚羥基，故本實驗采用加熱回流的方法從補骨脂中提取總呋喃香豆素，聚酰胺柱層析對總呋喃香豆素進行富集，以總呋喃香豆素量為考察指標，利用響應面分析法［6］，運用Design–Excerpt軟件對影響補骨脂中總呋喃香豆素量的主要因素進行考察和評價，以確定從補骨脂中提取總呋喃香豆素的最佳工藝。

1 儀器與材料

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。補骨脂購自本校中藥飲片廠，經本校藥學院熊耀康教授鑒定為Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實。補骨脂素(批號:110739-200613購自中國藥品生物制品檢定所)。聚酰胺(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)。所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 聚酰胺的預處理 取聚酰胺以95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中。用3～4倍體積的95%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣(或極少殘渣)。用2～2.5倍體積5%NaOH溶液洗滌，再用蒸餾水洗至pH值為中性，然后用2～2.5倍體積的10%鹽酸溶液洗脫，最后用蒸餾水洗脫至pH中性，烘干備用。

2.2 樣品溶液的制備 精密稱取補骨脂藥材10 g，加甲醇適量，加熱回流提取1.5 h，提取2次，合并濾液，加一定量聚酰胺粉末攪勻后靜置，揮干甲醇，裝柱，30%乙醇洗脫，洗脫液經干燥后加甲醇溶解，定容后得供試品溶液，備用。

2.3 總香豆素的測定［7］

2.3.1 對照品溶液的制備 取補骨脂素對照品4.0 mg，精密稱定，加甲醇溶解后定容至10 mL，再精密吸取1 mL，加甲醇定容至25 mL，搖勻，即得對照品溶液(每1 mL中含有補骨脂素 16 μg)。

2.3.2 標準曲線的繪制 精密吸取上述對照品溶液1、3、5、7、10 mL，加甲醇定容至10 mL，于245 nm處測定吸光度，并以吸光度為縱坐標，對照品質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得標準曲線方程y=123.05x+0.008 2(r=0.999 7)。結果表明補骨脂素在1.6～16 μg/mL質量濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.4 RSM法優化總呋喃香豆素提取工藝

2.4.1 實驗設計與結果 Box-Benhnken試驗是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法［8］。本實驗采用軟件Design–Excerpt 7.0.0中的 Box-Benhnken試驗設計原理，選取液料比(A)、提取溫度(B)和聚酰胺用量(C)為實驗的三因素，每個自變量的低、中、高水平分別以－1、0、1進行編碼(見表1)，以總呋喃香豆素質量分數(%)為響應值(Y)，響應面分析方案及結果見表2。

表1 實驗因素及水平

2.4.2 模型的建立及方差分析結果 利用 Design-Expert 7.0.0軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到補骨脂總呋喃香豆素提取率(Y)對液料比(A)、提取溫度(B)和聚酰胺用量(C)的二次多項回歸模型:Y=1.02+0.068A+0.408 7B+0.031C+0.042AB－ 0.023AC+0.014BC－ 0.031A2－0.057B2－0.167C2

表2 響應面分析方案及結果

該方程的相關系數R2=0.984 5，表明響應值Y(總呋喃香豆素提取率)實際值與預測值之間具有較好的擬合度，因此，該模型可以用于預測總呋喃香豆素提取率的實際情況。從方差分析結果(表3)可知，整體模型達極顯著水平(P＜0.01)，表明該二次方程模型比較顯著，該方程對試驗擬合較好，可以對不同條件下的補骨脂中總呋喃香豆素提取率進行預測。由表3可知，A、B、C2達到極顯著水平(P＜0.01)。C、AB、B2達到顯著水平(P＜ 0.05)。因此各具體實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。另外，該模型的變異系數(C.V)為3.00%，在可接受范圍內。

表3 響應面二次回歸方程方差分析

2.4.3 提取工藝的響應面分析與優化 根據回歸方程，應用Design-Expert 7.0.0軟件，選液料比、提取溫度和聚酰胺用量這3個因素，在保持1個因素編碼值為0時，其它2個因素與響應值關系的三維響應面圖和等高線圖，通過圖可以直觀的描述各因素對響應值(總呋喃香豆素得率)的影響和各個因素的交互作用。由圖可知，響應曲面均是卷曲向下的凸面，等高線近似為圓形，中心位于所考察區域內，說明在考察的區域范圍內存在響應值的極大值，且簡單的一次線性方程難以解析。對擬合方程求偏導，可以得到模型的最大值，即補骨脂總香豆素的理論最佳提取工藝條件為:加藥材18倍量的甲醇，80℃水浴提取兩次(1.5 h/次)，濾液加2.1倍量的聚酰胺粉末攪拌均勻，待甲醇揮干后上柱用30%的乙醇洗脫，其理論值質量分數為1.13%。實測值與預測值的對照圖見圖1。

圖1 實測值與預測值的對照圖

2.4.4 驗證性試驗 為檢驗模型預測的準確性，在最佳提取條件提取下，進行3次平行驗證試驗，總呋喃香豆素平均質量分數為1.16%，與理論值間的相對誤差為2.59%，說明響應面法優化提取補骨脂中總呋喃香豆素可行。

表4 驗證試驗結果

3 討論

響應面分析法是一種集統計學、數學建模和計算機科學為一身，用于優化工藝條件的有效方法［6］。常見的正交設計法和均勻設計法雖可同時考慮幾種因素，尋求最佳因素水平組合，但不能在給出的整個區域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式，從而無法找到整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值。而響應面分析方法是通過中心組合實驗研究幾種實驗因素間交互作用的一種回歸分析方法，具有實驗次數少、周期短，求得的回歸方程精度高等優點，并從圖形方面分析尋求最優實驗考察因素值，在實驗設計中更具優勢［9-10］。

本實驗通過響應面分析法，利用Design-Expert軟件對補骨脂中總呋喃香豆素的提取工藝進行優化，并得到回歸方程。回歸分析結果表明，液料比項、提取溫度項、聚酰胺用量的平方項對總呋喃香豆素含量影響極顯著，聚酰胺用量項、液料比和提取溫度項、提取溫度的平方項對總呋喃香豆素得率影響顯著，說明簡單的一次線性方程難以解析。通過擬合方程得到補骨脂總呋喃香豆素的提取最佳條件為:加藥材18倍量的甲醇，80℃水浴提取兩次(1.5 h/次)，濾液加2.1倍量的聚酰胺粉末攪拌均勻，揮干甲醇，裝柱，30%乙醇洗脫。模型對總呋喃香豆素含量預測最大值為1.13%，驗證值為1.16%，與預測值的相對誤差為2.59%，在誤差允許范圍內(20%)驗證值和預測值相吻合較好，說明回歸方程能較真實地反映各篩選因素對總香豆素提取率的影響，證明應用響應面法在提高補骨脂總香豆素提取率回歸模型較可靠。

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