HPLC法測定癌痛巴布劑中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿

李智勇， 鄧亞利， 孫冬梅

(1.廣東省中醫研究所廣東廣州 510095;2.華南農業大學制藥工程系，廣東 廣州 510642)

癌痛巴布劑是在中醫藥"內病外治"理論的指導下，將傳統中醫藥和現代經皮給藥理論相結合而研發的一種治療癌痛的中藥復方經皮給藥制劑。癌痛巴布劑由草烏、生天南星、赤芍、乳香、生姜等藥物組成，原為廣東省第二中醫院臨床實踐應用于治療各種惡性腫瘤所致疼痛的經驗處方，具有溫經通絡、消瘤止痛的功效，主要用于寒凝經脈、瘀血阻滯引起的癌癥疼痛。本實驗采用HPLC同時測定癌痛巴布劑中君藥草烏的主要有效成分烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿，為癌痛巴布劑的質量控制和保障臨床用藥安全提供參考依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國);VWD檢測器;電子天平BP-211D(Sartorius，德國)。癌痛巴布劑(批號:090916、090917、090918)(自制)。烏頭堿對照品(aconetine)(110720-200410)、次烏頭堿對照品(hyaconitine)(798-9403)、新烏頭堿對照品(mesaconitine)(799-9403)，均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱Elipse CDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相 乙腈-0.2% 冰乙酸(加三乙胺調節pH值為6.25)(29∶71);體積流量1.0 mL/min;檢測波長235 nm;柱溫30℃。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品適量，加0.01 mol/L鹽酸甲醇溶液制成每1 mL含烏頭堿26.8 μg、次 烏 頭 堿 72.6 μg、新 烏 頭 堿 對 照 品163.2μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品3片，除去蓋襯，剪碎，混勻，精密稱取約0.5片癌痛巴布劑，置具塞錐形瓶中，加無水乙醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，藥渣再加入無水乙醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，合并，濾液揮干，殘渣加10 mL 0.6 mol/L的鹽酸轉入分液漏斗中，加入乙醚萃取3次(20 mL，10 mL，10 mL)，取酸水層，加氨試液調pH值至9，加乙醚萃取3次(10 mL，10 mL，10 mL)，合并乙醚溶液，蒸干，加0.01 mol/L的鹽酸甲醇溶液溶解，轉入25 mL量瓶中并定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 按癌痛巴布劑的制備工藝制備缺草烏的陰性對照制劑，并按供試品溶液制備方法制成草烏陰性樣品溶液，按2.1項色譜方法測試，結果供試品中其他雜質峰亦不干擾各待測成分的測定，且分離理想，空白無干擾。見圖1～3。

圖1 新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of aconitine，mesaconitine and hypaconitine

圖2 癌痛巴布劑HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of Aitong Cataplasm

圖3 陰性樣品HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of negative sample

2.4.2 線性關系考察 精密吸取上述烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿混合對照品溶液 2、4、6、8、10、12μL進行色譜測定，按上述色譜條件測定峰面積，并以峰面積(Y)對進樣量(X)進行回歸，得標準曲線:烏頭堿:Y=1.173 9X+1.833 1，r=1;次烏頭堿:Y=1.265 1X+1.521，r=1;新烏頭堿:Y=1.272 4X+5.026 9，r=1，表明烏頭堿在 53.6 ～321.6 ng 進樣量范圍內線性關系良好，次烏頭堿在145.2～871.2 ng進樣量范圍內線性關系良好，新烏頭堿在326.4～1 598.4ng進樣量范圍內線性關系良好。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取上述烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿混合對照品溶液10μL，重復進樣5次，測得峰面積積分值 RSD分別為0.43%，0.11%，0.10%。

2.4.4 穩定性試驗 取癌痛巴布劑(批號:090916)，按樣品制備方法制成供試品液，分別在0、2、4、6、8h不同時間間隔進樣 10μL 測定，測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積積分值，RSD分別為0.76%，0.62%，0.46%，表明烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿在8 h內均穩定。

2.4.5 重復性試驗 按擬定的測定方法，對同一批樣品(批號:090916)分別制備供試液，共平行制備5份，測得峰面積并計算供試品中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿量，結果 RSD分別為 1.93%，1.81%，1.44%，表明重復性良好。

2.4.6 回收率試驗 取已測定的樣品(批號090916，每片平均含烏頭堿0.83 mg，次烏頭堿0.87 mg，新烏頭堿 7.54 mg，每片平均質量為 11.583 6 g)，分別精密加入一定量的烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對照品，按供試品制備與測定方法，以2.1項色譜條件測定，平行做6組，結果見表1。

表1 烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿加樣回收率測定結果(n=6)Tab.1 Results of recovery test of aconitine，mesaconitine and hypaconitine(n=6)

2.4.7 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。結果見表2。

表2 癌痛巴布劑中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿測定結果(n=3)Tab.2 Determination of aconitine，mesaconitine and hypaconitine in Aitong Cataplasm(n=3)

3 討論

3.1 測定指標的選擇 癌痛巴布劑為臨床實踐應用于治療各種惡性腫瘤所致疼痛的經驗方劑，草烏為君藥之一，其中所含烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、N-脫酸刺烏頭堿、滇烏頭堿等雙酯型二萜生物堿是其鎮痛麻醉的主要活性成分，以烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的量最高［1-4］。由于酸性染料比色法供試品溶液處理繁雜，并且最終需要進行脫水處理，否則將會對測定結果產生影響［5-7］。因此本試驗通過建立癌痛巴布劑中烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的HPLC測定方法，為癌痛巴布劑的質量控制和臨床用藥提供了依據。

3.2 提取方法的選擇 烏頭堿類成分在堿性條件下不穩定，尤其不適宜采用堿性溶劑例如甲醇、氨水浸泡等進行處理，本試驗曾采用純水、含水甲醇和不同濃度的乙醇作為溶劑進行提取，結果顯示，加熱后易使供試品膏體溶化，不易濾過，結果顯示，宜采用無水乙醇超聲處理提取，采用酸提堿沉法進行純化處理制備供試品;經過方法學考察顯示，加無水乙醇超聲處理2次，每次30 min，烏頭堿總堿的量即不再增加。在酸水溶解除雜過程中，曾采用加氨試液調pH值至8后以乙醚萃取，但由于烏頭總堿多處于離子狀態而不易被萃取出來，又由于烏頭堿在過強堿性條件下不穩定，故將pH調至9，效果較好。

3.3 流動相的選擇 文獻報道［8-11］烏頭堿定量測定多以甲醇和乙酸銨、三乙胺等調節pH值后為流動相，一般不易使烏頭堿、次烏頭堿、和新烏頭堿分離，或是色譜峰易產生拖尾、塌峰等現象，本研究采用乙腈 －0.2%冰乙酸(加三乙胺調節 pH值為6.25)為流動相，經過調節不同的比例，結果在比例為29∶71時即可使三者完全分離，峰形良好，并且陰性無干擾。

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