GC法同時測定粗壯女貞苦丁茶中4種揮發(fā)性成分

劉 莉， 李 清， 陳曉輝， 史 芳， 果德安， 畢開順

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016)

粗壯女貞Ligustrum robustum(Roxb.)Blume為木犀科女貞屬植物，是我國西南地區(qū)小葉苦丁茶的主流品種［1］，具有降壓、消炎、鎮(zhèn)痛、減肥、保肝與抗氧化等藥理作用［2-6］。粗壯女貞苦丁茶中含有較多揮發(fā)油，其組成主要為單萜烯、倍半萜烯類及其含氧衍生物、萜類化合物、脂肪族類化合物等［7-9］，其中芳樟醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到41.82%。芳樟醇具有抗菌、抗病毒和鎮(zhèn)靜等作用［10-11］。目前尚無關(guān)于粗壯女貞苦丁茶揮發(fā)油類成分定量測定的文獻(xiàn)報(bào)道。對粗壯女貞中主要揮發(fā)油成分進(jìn)行定量分析，有利于系統(tǒng)全面地評價粗壯女貞苦丁茶的質(zhì)量。因此本實(shí)驗(yàn)建立了同時測定粗壯女貞中芳樟醇、α-松油醇、β-月桂烯和D-檸檬烯的氣相色譜法。所建立的方法簡便、準(zhǔn)確，為粗壯女貞苦丁茶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了信息。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 7890A氣相色譜儀(Agilent公司);電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);電子天平(天津市天馬儀器廠);AGBP210S電子天平(德國Satorius公司);揮發(fā)油提取器。

1.2 試劑 β-月桂烯和D-檸檬烯對照品購自上海友思生物科技有限公司(純度均大于98%);芳樟醇(批號:1503-200001)購自中國藥品生物制品檢定所(純度大于99%);α-松油醇由湖南正清藥業(yè)提供(純度大于99%);正庚醛(純度大于98%)，購于常州新華活性材料研究所。正己烷(色譜純)，購自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司;無水硫酸鈉(分析純)，購自天津大茂化學(xué)試劑廠。

14批粗壯女貞苦丁茶分別購自云南，四川，沈陽等地中藥材或茶葉市場，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)生藥學(xué)教研室路金才教授鑒定為木犀科粗壯女貞Ligustrum robustum(Roxb.)Blume。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 DB-17毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25mm，0.25 μm);程序升溫，柱溫初始 60 ℃，以3℃/min升溫至75℃(保留5 min)，再以5℃/min升至85℃(保留3 min)，以8℃/min升溫至117℃(保留5 min)，最后以50℃/min升溫至240℃;進(jìn)樣口溫度:250℃;FID檢測器，檢測器溫度300℃;分流比:4 ∶1;進(jìn)樣量:1 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液 取 β-月桂烯、D-檸檬烯、芳樟醇和α-松油醇適量，精密稱定，置于同一25 mL量瓶中，加正己烷配成 β-月桂烯0.106 8 mg/mL，D-檸檬烯 0.161 0 mg/mL，芳樟醇 7.250 mg/mL，α-松油醇3.374 mg/mL的混合對照品溶液，4℃冰箱中保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 取正庚醛約100 mg，精密稱定，加正己烷配制成10.08 mg/mL的貯備液，4℃冰箱中保存，備用。

2.2.3 供試品溶液 取本品粉末約7.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加10倍量蒸餾水，連接揮發(fā)油測定器。自測定器上端加水充滿刻度部分，加正己烷1 mL，加熱至沸，保持微沸5 h，停止加熱，冷卻至室溫，分取正己烷層，加無水 Na2SO4約0.4 g，除去水分，取上層溶液至10 mL量瓶，精密加入0.25 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加正己烷定容，得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性考察 分別取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下測得正庚醛，β-月桂烯、D-檸檬烯、芳樟醇和α-松油醇的保留時間分別為 6.10 min，7.55 min，9.33 min，14.52 min 和19.77 min，結(jié)果顯示在對照品和內(nèi)標(biāo)保留時間處無雜質(zhì)峰干擾，供試品溶液中其他成分對測量無干擾，表明方法專屬性良好。典型色譜圖見圖1。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 分別精密量取混合對照品溶液 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、9.0 mL 置10 mL量瓶中，精密加入0.25 mL內(nèi)標(biāo)溶液正己烷定容至刻度，即得系列混合對照品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下測定。以對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比 (Y)為縱坐標(biāo)，以各對照品濃度為橫坐標(biāo)(X:mg/mL)，得回歸方程。見表1。結(jié)果表明，β-月桂烯、D-檸檬烯、芳樟醇和 α-松油醇分別在 2.700 ～ 95.4 μg/mL，4.000 ～144.0 μg/mL，181.2 ～6 525 μg/mL 和84.4～3 036 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 粗壯女貞苦丁茶中4種成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.1 Regression equation of four components in Ligustrum robustum(Roxb.)Bl.

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得β-月桂烯、D-檸檬烯、芳樟醇和α-松油醇的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD分別為1.7%，1.5%，1.1%和1.3%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取6份同一批號樣品，每份約7.5 g，精密稱定，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下測定，測得β-月桂烯、D-檸檬烯、芳樟醇和 α-松油醇 RSD分別為2.0%，1.3%，1.5%和1.9%，結(jié)果表明方法重復(fù)性好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于 0、2、4、8、12、24、48 h 在 2.1 項(xiàng)色譜條件下測定，測得 β-月桂烯、D-檸檬烯、芳樟醇和 α-松油醇與內(nèi)標(biāo)峰面積比的RSD分別為1.9%，1.4%，2.0% 和1.4%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.6 回收率試驗(yàn) 分別取已知量的同一批次粗壯女貞共9份，每份約3.8 g，精密稱定，以低、中、高濃度分別精密加入對照品溶液，每一濃度3份，按

2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 粗壯女貞苦丁茶中4種成分回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.2 Results of recoveries of four components in Ligustrum robustum(Roxb.)Bl.(n=9)

2.4 樣品測定 分別取14批粗壯女貞藥材，每份約7.5 g，精密稱定，按 2.2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下測定，以內(nèi)標(biāo)對比法計(jì)算樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)分別考察了HP-5，DB-1，DB-17毛細(xì)管色譜柱，結(jié)果表明DB-17色譜柱對待分離組分分離效果最好，因此選用DB-17中等極性毛細(xì)管色譜柱。

3.2 分別考察了提取用水量，萃取溶劑和提取時間對提取效率的影響，其中提取時間對提取效率影響較大。分別考察了提取時間為3、4、5、6 h時揮發(fā)油的提取量，結(jié)果表明提取5 h提取效率較高，繼續(xù)提取揮發(fā)油量無明顯變化。因此選擇5 h作為提取時間。最終確定以10倍量水提取5 h，并用正己烷萃取作為揮發(fā)油提取條件。

3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四川粗壯女貞老葉中揮發(fā)油各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯高于其嫩芽葉中揮發(fā)油各成分量，可能與干燥方法、干燥程度和儲存方法有關(guān);而云南產(chǎn)和四川產(chǎn)粗壯女貞的嫩芽葉比較，揮發(fā)油的量差異不明顯，川產(chǎn)粗壯女貞揮發(fā)油量略高。市場上粗壯女貞苦丁茶作為茶葉和袋泡茶飲用的商品主要來源于其嫩芽葉，而老葉則主要用以開發(fā)具有降脂、減肥、解酒、保肝等作用［12-13］的保健品。從定量測定的結(jié)果可以得知，芳樟醇在各批次粗壯女貞中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較大，表明芳樟醇與粗壯女貞苦丁茶揮發(fā)油的藥理活性可能有著密切的關(guān)系。

［1］鄭道君，梁遠(yuǎn)發(fā)，劉國民，等.木犀科苦丁茶種質(zhì)資源的RAPD 分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(12):4164-4172.

［2］陳 一，何興全，謝唐貴，等.粗壯女貞的降壓作用［J］.中草藥，1995，26(7):360.

［3］吳建云.粗壯女貞抗炎及鎮(zhèn)痛作用的觀察［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1999，19(8):458.

［4］黃林芳，萬德光.西南民間藥苦丁茶的抗炎作用研究［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，2004，23(3):180.

［5］黃林芳，萬德光.川產(chǎn)苦丁茶的減肥作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(3):49.

［6］Lau K T，He Z D，Dong H，et al.Anti-oxidative，anti-inflammatory and hepato-protective effects of Ligutrum robustum［J］.J Ethnophamac，2002，16(3):268.

［7］童華榮，高愛紅，袁海波，等.女貞苦丁茶揮發(fā)油成分分析［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2004，13(1):53-55.

［8］李 麗.小葉苦丁茶質(zhì)量控制方法研究與紫草科苦丁茶的親緣學(xué)意義初探［D］.北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2009.

［9］黃林方.川產(chǎn)苦丁茶品種、品質(zhì)研究［D］.四川:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2002.

［10］朱亮鋒.芳香植物及其化學(xué)成分［M］.?？?海南人民出版社，1988:87.

［11］中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志:第三冊［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1984:35.

［12］陳瑞儀，譚劍斌，王鳳巖，等.苦丁茶提取物對酒精性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中國現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志，2007，4(4):301-302.

［13］楊杏林，范海鷹.中藥苦丁茶的研究開發(fā)述評［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥雜志，2003，(3):35-37.