正交試驗法優選紅參加工工藝

李卓艷， 李德坤， 周大錚， 葉正良， 李 萍

(1.中國藥科大學中藥學院，江蘇南京 210009;2.天津天士力之驕藥業有限公司，天津 300402)

人參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，主要分布于東北三省。人參中化學成分復雜，但是普遍認為主要有效成分是人參皂苷，約占4%。一般人參炮制后入藥，其中，紅參是最常見的炮制品。經過炮制后的紅參除了容易保存外，還降低了有神經毒害的田七素，并且形成了新的人參皂苷，如抗腫瘤活性的Rg3和Rh2［1-5］。

近期對東北人參資源考察過程中發現，紅參加工廠的紅參加工工藝各不相同，這樣勢必造成紅參內在質量的差異。這些加工廠注重的是紅參的外在質量，對皂苷類成分的量及皂苷類指紋圖譜并不關注。所以市場上紅參質量參差不齊，同時由于品牌多且雜，企業間的內耗導致中國紅參至今無法與西洋紅參、高麗紅參相抗衡。

為了給生產廠家提供一個統一的質量標準，我們參考加工廠的工藝，首次以人參總皂苷和高活性人參皂苷Rg3共同作為指標，采用正交加工方法對紅參加工工藝進行優化［6-7］。

1 材料與儀器

1.1 材料 5年生鮮人參，鑫泰藥業提供，經天津天士力之驕藥業有限公司楊悅武研究員鑒定，為人參Panax ginsengC.A.Mey。

1.2 對照品 人參皂苷Re、Rg3為中國藥品生物制品檢定所購買(批號為110754-200822、110804-200402)。

1.3 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，2489紫外檢測器;Hach DR 5000紫外分光光度計;DIKMA ProElutTMSPE小柱。

2 實驗方法

2.1 紅參加工正交試驗設計 采用正交設計試驗，對紅參蒸制時間、烘干溫度、烘干時間進行條件優選［8］，考察指標為人參總皂苷以及高活性皂苷Rg3。用L9(34)正交表安排實驗。因素水平表見表1。

表1 因素水平Tab.1 Levels of factors

蒸制時間分為3階段，50 min升溫階段，恒溫階段和30 min降溫階段，3階段時間總和為正交表中蒸制時間［9-10］。試驗烘干過程采取二次烘干法，第1次烘干根據正交試驗表進行，第2次是把第一次烘干好的人參統一放入50℃的烘箱中烘至完全干為止［11-12］。實驗共得9種紅參樣品。

2.2 人參總皂苷的測定

2.2.1 供試品溶液的制備 取紅參100 g(紅參原藥材去蘆頭)，粉碎過4號篩，混勻，取5 g粉末，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入三氯甲烷50 mL加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液［1］;然后藥渣揮干溶劑后，加入85%乙醇回流提取2次，每次加入量為40 mL，回流時間分別為2 h和1 h。提取液減壓回收乙醇至無醇味，用0.5 mol/L氫氧化鈉的20%的甲醇溶液轉移定容至50 mL量瓶中。精密量取上述溶液10 mL，上預先處理好的DIKMA ProElutTMSPE小柱(先用約10 mL甲醇沖洗，再用0.5 mol/L的氫氧化鈉的20%甲醇溶液約5 mL沖洗處理)，以0.5 mol/L的氫氧化鈉的20%甲醇溶液5 mL沖洗，流出液棄去，再以20%甲醇溶液10 mL沖洗，流出液棄去，最后用甲醇洗脫收集于10 mL量瓶中至近刻度，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Re對照品，加甲醇制成每1 mL含1.736 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 測定 精密量取對照品溶液20、40、60、80、100 μL及供試品溶液40 μL，分別置10 mL具塞試管中。置水浴中揮盡溶劑后取出，放冷，精密加新配制的5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混和液(2∶8)1 mL，搖勻。置60℃水浴中加熱15 min，取出，立即置冰浴中冷卻2 min。精密加冰醋酸5 mL，搖勻，在室溫下放置5 min。以相應試劑為空白，在550 nm處測定吸收度，計算，即得。

2.2.4 方法學考察 應用該方法測定紅參藥材中的人參總皂苷，標準曲線為y=0.473 4x－0.012 2(0.347 mg/mL≤x≤1.736 mg/mL)，r2=0.999 2;重復性(n=6)RSD為1.33%;加樣回收率(n=6)均在98.27% ～101.83%之間，RSD 為 1.40%。說明該方法可用于測定藥材中人參總皂苷。

2.3 人參皂苷Rg3的測定

2.3.1 供試品溶液的制備 同2.2.1項。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg3對照品，加甲醇分別制成每 1 mL含 0.400 mg、0.200 mg、0.100 mg、0.050 0 mg、0.010 0 mg 的溶液，搖勻。

2.3.3 色譜條件 Diamonsil TM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;以乙腈為流動相 A，以 0.05%磷酸溶液為流動相B，按表2進行梯度洗脫;檢測波長為203 nm;柱溫為30℃;體積流量1.0 mL/min;積分范圍8～70 min。分別取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入色譜儀，測定。該色譜條件下，Rg3得到較好的分離。見圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Mobile phase program of gradient elution

圖1 人參總皂苷Rg3對照品及紅參藥材樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substance of Rg3and Ginseng Radix et Rhizoma rubra

3.3.4 方法學考察 應用該方法測定紅參藥材中的人參皂苷Rg3，標準曲線為y=8×106x+1 733.9(0.010≤x≤0.400 mg/mL)，r2=0.999 9;儀器精密度(n=5)RSD為0.10%;重復性(n=6)RSD為1.09%;樣品在24 h內穩定性RSD為0.46%;加樣回收率(n=6)均在98.13% ～100.74%之間，RSD為1.06%。說明該方法準確穩定，可用于測定藥材中人參皂苷Rg3。

3 實驗結果

3.1 正交試驗結果 見表3。

表3 正交試驗結果Tab.3 Results of the orthogonal test

3.2 人參總皂苷的方差分析 見表4。

3.3 人參皂苷Rg3的方差分析結果 見表5。

表5 方差分析結果-人參皂苷Rg3Tab.5 Variance analysis results of ginseng Rg3

4 分析與討論

4.1 由表3和表4，因素A對人參總皂苷有極顯著性影響(P＜0.01)，因素 C有一定影響(P＜0.10)，各因素對人參總皂苷影響的主次關系為A＞C＞B。從均值看，因素A和C各水平順序均為K2＞K1＞K3，說明3個水平中，A2C2，即蒸制4 h，烘干10 h總皂苷質量分數最高。

4.2 由表3和表5，因素B和C對人參皂苷Rg3有一定影響(P＜0.10)。各因素對人參皂苷Rg3影響的主次關系為C＞B＞A。從均值看，因素C各水平順序為K1＞K2＞K3，因素B各水平順序為K3＞K2＞K1，說明3個水平中，B3C1，即70℃烘干8 h Rg3最高。

4.3 綜合考慮人參總皂苷和Rg3的質量分數，我們最終選擇的最優加工方案為A2B3C1，即鮮人參洗盡后，蒸制4 h，70℃下烘8 h，然后在50℃下徹底烘干。

5 驗證試驗

按上述優化的最佳條件，加工3批紅參藥材，并檢測其人參皂苷Rg3和總皂苷。結果見表6。3批驗證試驗結果表明該工藝穩定可行。

表6 3批紅參加工試驗結果Tab.6 Test results of samples

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