當歸四逆湯有效成分組合對大鼠缺血再灌注模型中iNOS eNOS表達相關性的實驗研究

錢國強， 蔡 川， 梁雪冰， 趙國平

(暨南大學醫學院，廣東廣州 510632)

當歸四逆湯為《傷寒論》治療血虛寒厥之方劑，現代藥理研究表明該方有抗凝、抗血栓、擴血管、鎮痛抗炎的作用［1］，臨床運用于凍傷、血栓閉塞性脈管炎、雷諾氏綜合征、冠心病、下肢動脈閉塞以及靜脈血栓形成［2］，目前在該方中發現了 4 種有效成分［3］，且芍藥苷［4－7］、阿魏酸［8］、甘草酸［9］、肉桂酸［10］均對缺血再灌注損傷有干預作用。缺血預處理(ischemic preconditioning，IP)可明顯減輕隨后的缺血再灌注損傷，但其機制尚有待于研究。以至于缺血與處理有關的物質腺苷、乙酰膽堿、緩激肽等均可促進eNOS誘導的一氧化氮(nitric oxide，NO)合成，提示NO可能參與了缺血預處理。本研究采用當歸四逆湯有效成分單體組合進行藥物缺血預處理，研究當歸四逆湯缺血預處理對大鼠心肌的保護作用及其機制，以期探尋其是否與NO途徑有關。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠32只，體質量250～300 g(購自廣東省實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2008－0002)。

1.2 試劑及器材 芍藥苷、阿魏酸、甘草酸、肉桂酸(購自南京澤朗醫藥科技有限公司)，L－NAME(sigma公司)，NO ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)、肌酸激酶同工酶(CK－MB)測定試劑盒(北京華宇億康生物科技有限公司)。全自動生化分析儀(日立7020)，動物呼吸機(ALC－V，

上海奧爾科特生物科技有限公司)，全波長熒光掃描酶標儀(Safire 2，北京東勝創新生物科技有限公司)，心電圖機(生物機能實驗系統，成都遨升電子公司，型號:ASB240V)，PCR儀(BIO－RAD，CFD－3120)。

2 方法

2.1 模型與分組

2.1.1 心肌缺血再灌注模型建立 SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg體質量)，固定后行氣管切開，氣管插管，連接呼吸機并給予機械通氣，通氣量為5 mL/100 g體質量;呼吸頻率為60～80次/min，呼吸比為2∶1，予呼氣末持續正壓呼吸，于胸骨左緣2～4肋間打開胸腔及心包膜，暴露心臟;在肺動脈圓錐右緣、平左心耳下緣1～2 mm處，經左冠狀動脈下淺層心肌穿5/0號絲線，結扎，模型復制的可靠性用連續監視ECGⅡ導聯的變化來判斷，以ST段抬高為心肌缺血存在，以ST段回落1/2為再灌注成功。

2.1.2 實驗分組 32只大鼠分為4組(正常組，IR組，IR+藥組，IR+藥+L－NAME組)，每組8只。正常組未經缺血再灌注處理;IR組SD大鼠心肌缺血30 min再灌注120 min后取材;IR+藥組于實驗前30 min灌胃，灌胃劑量為甘草酸50 mg/kg，阿魏酸 400 mg/kg，芍藥苷 100 mg/kg，肉桂酸 400 mg/kg［3］，再灌注120 min 取材;IR+ 藥 +L－NAME 組于實驗前30 min灌胃，灌胃劑量為甘草酸50 mg/kg，阿魏酸400 mg/kg，芍藥苷100 mg/kg，肉桂酸400 mg/kg，并于再灌注前15 min給予 L－NAME 30 mg/kg，再灌注120 min取材。

2.2 NO檢測 取血后靜置30 min，4℃離心15 min，取血清按照試劑盒說明檢測。

2.3 CK－MB檢測 按照(CK－MB)測定試劑盒在全自動生化儀上進行。

2.4 eNOS mRNA和iNOS mRNA的測量 采用實時熒光定量法測定eNOS mRNA和iNOS mRNA的測量，以DAPDH為內參，DAPDH 引物為:5′－ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC－3′和 5′－TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA－3′，eNOS 引物為5′－CGA GAT ATC TTC AGT CCC AAG C－3′和 5′－GTG GAT TTG CTG CTC TCT AGG－3′，iNOS 引物設計為 5′－TCT GTG CCT TTG CTG ATG AC－3′和 5′－CAT GGT GAA CAC GTT CTT GG－3′，RNA抽提按照試劑盒說明進行，測純度 OD260/290在1.9～2.1之間良好，按照試劑盒說明書將反應設為50 μL體系，95℃變性2 min，40循環擴增(95 ℃10 s，60 ℃ 15 s，68℃ 30 s)，完成實驗后數據采用2－ΔΔct分析。

2.5 統計分析方法 所有數據以均數±標準差表述，組間差異比較用單因素方差分析，兩兩數據比較用SNK檢驗。

3 結果

3.1 NO、CK－MB 檢測結果 見表1。

表1 測得NO、CK-MB質量濃度方差分析結果

3.2 eNOS mRNA、iNOS mRNA的測定結果 見表2。

表 2 eNOS mRNA、iNOS mRNA 測得量(2 －ΔΔct)

4 討論

1987年Palmer等［11］發現NO就是內皮源性舒張因子(endothelium－derived relaxing factor，EDRF)，目前研究認為在基礎狀態下血管內皮細胞的NO釋放對維持心血管系統處于恒定的舒張活性狀態，調節血壓，調節冠狀動脈基礎張力和心肌血流灌注有重要作用。NO使血小板中cGMP水平升高，導致胞漿游離鈣進入亞細胞器而使其濃度降低，從而抑制其聚集黏附［12］，在血管內皮細胞、平滑肌細胞及粒細胞中均有NO存在，在炎癥時它過量產生可以使血管通透性增加，炎細胞、蛋白滲出加劇。有研究提示心肌缺血再灌注后NO生成受損，應用NO前體L－精氨酸增加NO產生，具有保護作用［11］。有研究證實 NO對缺血再灌注有保護作用［13］，有研究表明一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑L－NAME等減少了NO的生成，并未加重損傷［14］，也有研究表明減少NO生成以后，使損傷明顯加重［15］。另有報道缺血－再灌注心肌NO產生大量增加，應用NOS抑制劑L－單甲基精氨(L－NMMA)和 L－硝基精氨酸甲酯(L－NAME)抑制NO的產生，能夠減低心肌損傷［16］，又有實驗證實，缺血再灌注心肌過量NO的產生系心肌iNOS活性升高所致，過量NO參與心肌脂質過氧化，損傷心肌［17］。我們的實驗研究表明，缺血再灌注的心肌iNOS表達升高，eNOS表達降低，再灌注期間NO生成減少，CK－MB生成增加。故可以認為，再灌注期間NO的產生，是基于心肌NOS同工酶的變化。本研究認為當歸四逆湯有效成分組合對缺血再灌注心肌有保護作用，其保護作用通過調節iNOS mRNA和eNOS mRNA表達，調節NO生成，從而起到保護心臟的作用。

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