隔山消不同極性提取物抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究

洪小鳳， 王 濤， 施貴榮， 王立云， 李 輝*

(1.云南省大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理 671000;2.云南省大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000)

紫地榆Geranium strictipesKnuth，牻牛兒苗科老鸛草屬植物，藥用部位為根，民間稱隔山消。該藥在《大理中藥資源志》、《中藥大辭典》、《全國中草藥匯編》等書籍中均有收載。其在民間主要用于治療厭食、腸炎、紅白痢疾、消化不良等病癥［1］。已報道的化合物主要是鞣質(zhì)類和酚酸類［2］，而對該藥的有關(guān)藥理、毒理、臨床應(yīng)用、藥材標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究報道都非常少。為了探討隔山消在民間治療腸炎、紅白痢疾的藥理作用基礎(chǔ)，本課題組前期對隔山消粗提取物的體內(nèi)外抗菌作用進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的廣譜抗菌作用［3］。為此，我們進(jìn)一步研究隔山消不同極性部位提取物對臨床分離的耐藥菌株和常見致病菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥材 隔山消，購自大理集盛大藥房。經(jīng)鑒定為牻牛兒苗科植物紫地榆Geranium strictipesKnuth的干燥根。

1.2 供試菌株 金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、質(zhì)控菌金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922，均由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物教研室惠贈。

所有31株臨床分離金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌來自大理州醫(yī)院住院病人和門診病人。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色特點(diǎn)和膠乳凝集試驗(yàn)，經(jīng)VITEK-32全自動微生物分析儀GPI鑒定卡(法國生物梅里埃公司生產(chǎn))做菌株鑒定。共鑒定出MRSA13株、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌15株、銅綠假單胞菌1株。

1.3 培養(yǎng)基 MH瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司，批號:090817);MH肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司，批號:090526)。

1.4 儀器設(shè)備 AV-3070垂直型超凈工作臺(TELSTAR)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 耐藥菌株的篩選 采用液體稀釋法，參照NCCLS/CLIS2006 標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果［4］。

1.5.2 藥物的提取 取隔山消10.95 kg，粉碎后用85%乙醇回流提取3次。合并提取液減壓濃縮得乙醇浸膏3.58 kg。浸膏用甲醇溶解后，用80～100目硅膠拌樣，過硅膠柱層析，然后分別用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮洗脫，濃縮各組分得石油醚部分、三氯甲烷部分、乙酸乙酯部分、丙酮部分。因石油醚部分和三氯甲烷部分量太少，此次實(shí)驗(yàn)只做乙酸乙酯部分及丙酮部分。臨用前取乙酸乙酯和丙酮部分低溫冷凍干燥成粉末，再用適當(dāng)溶劑配制成所需濃度。

1.5.3 抑菌圈試驗(yàn)菌片的制備 將定性濾紙制成6 mm直徑的圓片，高壓蒸汽滅菌，干燥保存?zhèn)溆谩Ｈ√幚砗玫臑V紙片放入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每100片紙片滴加隔山消提取液100 μL，對照組滴加100 μL溶劑，每片含生藥量約為2.57 mg。1.5.4 細(xì)菌懸液的制備［5-6］將所有供試菌株分別接種于MH瓊脂平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h活化，待用。挑取瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落，用滅菌生理鹽水校正菌液濃度，使其相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用MH肉湯稀釋至含菌量約107CFU/mL。稀釋后的菌液在15 min內(nèi)接種。

1.5.5 MIC及MBC的測定［5-6］取滅菌小試管15支為一組。其中每組第13、14、15管分別標(biāo)上“肉湯對照”、“檢測菌對照”、“溶劑對照”。每支試管分別加入MH肉湯2 mL。配制隔山消乙酸乙酯提取物和丙酮提取物原液濃度為100 mg/mL。用吸管吸取藥液2 mL放入第1管內(nèi)，混勻后吸取2 mL放入第2管，同樣混勻后吸出2 mL放入第3管。依此法逐管進(jìn)行稀釋至第12管。各管藥物濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg/mL，除“肉湯對照”管外其余各管均加入菌液0.1 mL，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察生長情況。在對照管符合要求的情況下，以肉眼未見生長的最低藥物濃度為隔山消對細(xì)菌的MIC。再從未見細(xì)菌生長的試管中取0.02 mL于相應(yīng)培養(yǎng)基的瓊脂平板上作次代培養(yǎng)，培養(yǎng)過夜，觀察有無細(xì)菌生長。平皿上計(jì)數(shù)少于5個菌落的最低藥物濃度為隔山消對細(xì)菌的MBC。

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.5.6 K-B實(shí)驗(yàn)法 用無菌棉簽蘸取0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后在瓊脂表面均勻涂布，然后將含藥紙片貼于瓊脂表面。置37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育18～20 h后觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑。各稀釋液的每項(xiàng)抑菌圈實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)6次。

結(jié)果判斷:抑菌圈直徑大于6 mm者為有抑菌作用，小于或等于6 mm者判為無抑菌作用。溶劑對照組應(yīng)無抑菌圈產(chǎn)生，否則試驗(yàn)無效。

2 結(jié)果

2.1 隔山消提取物對各供試菌株的MIC和MBC測定

隔山消乙酸乙酯提取物和丙酮提取物對各實(shí)驗(yàn)菌株的MIC和MBC測定結(jié)果見表1。

表1 隔山消提取物對各實(shí)驗(yàn)菌株的MIC及MBC結(jié)果

由表1結(jié)果顯示，隔山消提取物對各實(shí)驗(yàn)菌株均有不同程度的抑制作用，對葡萄球菌、痢疾志賀菌的抑制作用最強(qiáng)，乙酸乙酯部分MIC值均為0.39 mg/mL，丙酮部分均為0.78 mg/mL。對枯草芽孢桿菌作用次之，乙酸乙酯部分MIC值為1.56 mg/mL，丙酮部分為 3.125 mg/mL。

2.2 隔山消提取物紙片擴(kuò)散法的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，100、50、25 mg/mL的乙酸乙酯和丙酮提取物對MRSA及標(biāo)準(zhǔn)菌株均有明顯抑制作用，并且隨著濃度降低抑菌圈明顯縮小(與對照組比較，P﹤0.001)。乙酸乙酯提取物抑菌圈大于相應(yīng)濃度的丙酮提取物，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.001)。各相應(yīng)濃度抑菌圈直徑與ATCC25923比較沒有明顯差異。

表2 隔山消提取物對13株MRSA菌株的抑制作用

表3結(jié)果顯示，隔山消提取物50、25、12.5 mg/mL 3個濃度對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、痢疾志賀菌、枯草桿菌有不同程度的抑菌效果。

3 討論

目前，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的腸桿菌科細(xì)菌已成為一些大型綜合醫(yī)院最常見的醫(yī)院感染菌。同時又表現(xiàn)為多重耐藥性，給臨床治療帶來了極大的困難。

表3 隔山消提取物對各實(shí)驗(yàn)菌株的抑制作用

本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隔山消總提取物具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，因此擬定對其抗菌活性部位進(jìn)行進(jìn)一步追蹤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隔山消總提取物經(jīng)硅膠柱層析得到的乙酸乙酯部分和丙酮部分對各菌株均顯示出不同程度的體外抗菌活性，尤其是對葡萄球菌科細(xì)菌及痢疾志賀菌的抑制作用最強(qiáng)。整體來講，乙酸乙酯提取物抑制細(xì)菌生長的作用較丙酮提取物略強(qiáng)。同一種提取物對MRSA、產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的不同菌株表現(xiàn)出相近的抑菌活性。并且，隔山消提取物對臨床分離株和教學(xué)用的實(shí)驗(yàn)菌株也表現(xiàn)出相近的抑制作用。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隔山消兩種提取物對MRSA均有很強(qiáng)的抗菌活性，尤其是乙酸乙酯部分。目前，本課題組正針對乙酸乙酯部分進(jìn)行進(jìn)一步的分離及活性追蹤，以期篩選出抗菌活性更強(qiáng)的天然抑菌劑。

［1］中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志［M］.第5卷，北京:科學(xué)出版社，1991:85.

［2］楊國紅，陳道峰.紫地榆的化學(xué)成分及其抗艾滋病病毒活性［J］.中草藥，2007，38(3):352-354.

［3］張嫻文，李鳳賢，王 晶.隔山消的抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.中成藥，2009，31(6):127-129.

［4］NCCLS.Performance Standards for Antimicrocbial Susceptility Testing:Sixteenth Informational Supplement［S］.National Committee for Clinical Laboratory Standards，2006.

［5］陳 奇，卞如濂，陳 修.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.2版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:274-277.

［6］李志富，毛文奎，邵 偉，等.石榴皮乙醇提取物對臨床分離菌株的抗菌作用及毒性試驗(yàn)研究［J］.中國消毒學(xué)雜志，2009，26(2):162-164.