烏飯樹葉總黃酮體外抗氧化活性

蔡凌云

(1.貴州省凱里市凱里學院環境與生命科學學院，貴州凱里 556011;2.四川省南充市西華師范大學生命科學學院;西華師范大學生命科學學院，西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川南充 637002)

烏飯樹Vaccinium bracteatumThunb為杜鵑花科Erioaoeae越桔屬Vaccinium植物，據《中藥大辭典》載，烏飯樹葉具有益精氣、強筋骨、明目、止泄的功用，內含有花青素、β-谷甾醇、熊果酸、藍黑色素(主要成分是槲皮素)、異葒草素、對羥基桂皮酸、內消旋肌醇、α-亞麻酸、烏索酸、齊墩果酸、三十一烷及鞣質等成分。烏飯樹葉具有促進視紅素再合成，Vp樣機能、改善血液微循環、抗潰瘍、抗炎癥、抗衰老等多種藥理活性［1-5］。國外學者研究其漿果的抗氧化活性［6-7］，但目前對烏飯樹葉的抗氧化性研究在國外尚未見報道，近年來，我國學者對烏飯樹葉的化學成分和分離出來的黃酮單體的抗氧化活性進行過研究［8-14］，本實驗提取烏飯樹的總黃酮類物質并純化，進行總黃酮抗氧化性的研究，用SPSS軟件進行相關分析、差異性分析和回歸分析，為開發烏飯樹這一天然的食品抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 烏飯樹2010年5月采集于貴州省黔東南州臺江縣，經環境與生命科學學院周江菊教授鑒定為杜鵑花科越桔屬植物烏飯樹。標本保存于凱里學院環境與生命科學學院標本室。

DPPH:日本和光純藥，供應商:上海如吉生物技術有限公司。蘆丁(中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，純度≥98%，編號:1097-060918)。

磷酸鈉、鉬酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、乙醇等均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備 R-200旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI公司。eppendorf Research移液器，德國 Eppendorf AG公司。UV-2102C型紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司。格蘭仕微波爐G8023CSL-K3:格蘭仕微波爐電器有限公司。低速離心機LD4-2:北京醫用離心機廠。BT124S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理和提取液制備 自然干燥的烏飯樹葉粉末分別過60目篩，置于干燥器中備用。精確稱取上述粉末50.000 g，置錐形瓶中，加80%乙醇，料液比為1︰15，微波間歇提取2次，每次100 s，微波功率320 W，合并提取液，濃縮至無醇味，上HPD-600藥用大孔吸附樹脂柱，水洗除雜質，70% 乙醇洗脫。吸附體積流量為0.5 mL/min，洗脫體積流量為2 mL/min。洗脫液用于測定其中黃酮量和抗氧化活性實驗。

1.3.2 提取物中黃酮的測定和蘆丁標準曲線的制備 采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法，在波長為510 nm測定吸光度。

精確稱取120℃減壓干燥至恒重的蘆丁標準品用乙醇溶解后，定容，得對照品液(0.5 mg/mL)。精密量取蘆丁對照品溶液 0.00、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 分別放入 1～6號10 mL量瓶中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加4%NaOH溶液3mL，再用乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min，測定吸光度。取經稀釋定容的上述烏飯樹葉總黃酮洗脫液，如上方法測定吸光度。

1.3.3 DPPH·自由基的清除率測定 在試管里分別加入不同質量濃度的洗脫液 2 mL(20、25、30、35、40、45 mg/L，每個質量濃度做3個平行)，然后依次加入2 mL 2 mmol/L DPPH·，搖勻，在25℃水浴加熱反應30 min，取出，測定在517 nm處的吸光度，此時為Ai。另取試管，加入2 mL蒸餾水代替樣品，測樣品的A0，另取試管，用蒸餾水代替DPPH·測定樣品本底吸光度，此時為Aj。根據下式計算對DPPH·的清除率，比較樣品和Vc的抗氧化能力。

1.3.4 對羥基自由基的清除率的測定 在試管里分別加入不同質量濃度的洗脫液各 2 mL(20、25、30、35、40、45 mg/L，每個質量濃度做3個平行)然后依次加入2 mL 2 mmol/L硫酸亞鐵，2 mL 6 mmol/L的水楊酸，2 mL 1 mmol/L的雙氧水混勻啟動反應，在37℃水浴加熱30 min，510 nm處測定吸光度，此時為樣品Ai。另取試管，加入2 mL蒸餾水代替樣品，重復上述實驗，在510 nm處測定吸光度，此時為樣品A0。在試管里分別加入不同質量濃度的提取液各2 mL(20、25、30、35、40、45 mg/L，每個質量濃度做 3 個平行)然后依次加入2 mL 2 mmol/L硫酸亞鐵，2 mL 6 mmol/L的水楊酸，2 mL蒸餾水代替雙氧水混勻，在37℃水浴加熱30 min，510 nm處測定吸光度，此時為樣品Aj。

1.3.5 抑制濃度EC50的求算 用SPSS 11.5軟件以樣品質量濃度與抑制率作回歸分析，根據擬合方程求出抑制率為50%時所需樣品的質量濃度，即半抑制濃度EC50。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線 在510 nm下測定標準品溶液的吸光值，作線性回歸，可得蘆丁質量濃度C與吸光度A間的回歸方程為A=12.702C－ 0.020 9。

2.2 抑制濃度EC50以烏飯樹葉總黃酮質量濃度(X)與抑制率(Y)作回歸分析。

DPPH·清除率的回歸方程為:Y=10.303+1.780X，相關系數R=0.966(P＜0.001)。

OH·清除率的回歸方程為:Y=41.336+0.228X，相關系數R=0.872(P＜0.001)。

根據回歸方程計算得烏飯樹葉總黃酮對DPPH·和OH·的 EC50分別為22.30 mg/L 和38.00 mg/L，說明烏飯樹葉總黃酮的抗氧化能力強，是良好的天然抗氧化劑。

2.3 烏飯樹葉總黃酮對DPPH·自由基的清除率 如圖1所示，質量濃度對烏飯樹葉清除DPPH·影響極其顯著，相關系數分別達0.987，并隨總黃酮質量濃度增大而清除率增大。分析表明，在所選質量濃度范圍內，烏飯樹葉在黃酮質量濃度為45 mg/L時，對DPPH·的清除率最高，與其他質量濃度具有極顯著差異(P＜0.01)。烏飯樹樹葉總黃酮對DPPH·具有相當強的清除能，其EC50達22.30 mg/L。

圖1 對DPPH·的清除率

2.4 烏飯樹葉總黃酮對羥基自由基的清除率 如圖2所示，質量濃度對烏飯樹葉清除OH·影響極其顯著，相關系數分別達0.872，并隨總黃酮質量濃度增大而清除率增大。分析表明，在所選質量濃度范圍內，烏飯樹葉在總黃酮質量濃度為45 mg/L對OH·的清除率最高，與其他質量濃度比具有極顯著差異(P＜0.01)。質量濃度為40 mg/L、35 mg/L、30 mg/L時，質量濃度變化對自由基清除率的影響沒有顯著性差異，質量濃度為30 mg/L、25 mg/L時，質量濃度變化對自由基的清除率的影響也沒有顯著性差異，質量濃度為25 mg/L與20 mg/L時，質量濃度變化對自由基的清除率的影響具有極顯著差異(P＜0.01)。烏飯樹樹葉總黃酮對OH·具有相當強的清除能，其EC50達38.00 mg/L。

圖2 對羥基自由基的清除率

3 結論和討論

3.1 在生命活動的過程中，氧化代謝反應會產生各種自由基，適量自由基對細胞的分裂、生長、消炎、解毒等起積極作用。但是自由基過多或清除過慢會使生物大分子受到攻擊，加速機體的衰老進程，并誘發炎癥、惡性腫瘤、免疫失調等多種疾病［18］。為了抑制自由基損傷，人工合成的抗氧化劑被大量應用于食品、化妝品和醫藥等領域，化學合成制品大多有毒副作用，長期攝入合成抗氧化劑可導致肝損傷并誘發惡性腫瘤［15］，因此從天然產物中尋找低毒或無毒的抗氧化有效成分具有十分重要的意義。天然黃酮、皂苷、多糖等化合物對物理、化學以及生物等因素產生的自由基具有清除作用，有望作為天然抗氧化劑使用。

3.2 我們通過選用清除自由基DPPH·和OH·法，對烏飯樹葉總黃酮體外抗氧化活性進行了檢測。2，2-二苯代苦味肼基(DPPH)自由基是一種合成的有機自由基。常用來研究酚類抗氧化劑的構效關系，此法是依據DPPH在517 nm處有一強吸收和其乙醇溶液呈紫色的特性，在有自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收消失，其褪色程度與其接受的電子數成定量關系，因而可用分光法進行定量分析。María等［16］用DPPH法測石榴汁、維生素C、和葡萄酒的總的抗氧化能力，將清除DDPH 50%所用量定義為EC50，用來作為抗氧化能力的指標。郝曉麗等［17］用DDPH自由基清除法測定了多種植物(馬齒莧，扁蓄，車前草等)的清除自由基的能力。在測定樣品對DPPH自由基的清除能力時可通過計算EC50，TEC50(清除DDPH 50%所需用量時所用的時間)和AE(清除效率)等參數來反映抗氧化劑清除自由基反應的動力學行為［18］。對羥基自由基的清除作用采用水楊酸法。通過Fenton反應產生的·OH氧化水楊酸產生對510nm光有特征吸收的2，3-二羥基苯甲酸，通過測定水楊酸捕獲·OH所得到的產物確定·OH的清除率。

3.3 我國民間有采食烏飯漿果的習慣，有些地方用于制造果醬和釀酒但是沒有形成規模，國外對于烏飯樹樹果的研究報道也有，烏飯樹提取物中以前花青素和槲皮素為代表的植物多酚類為主。近年來，通過廣泛而深入的研究，植物多酚已被稱為第7營養素，烏飯樹葉提取物中含有大量的植物多酚這一特點，決定了其具有很高的營養保健價值。我們對烏飯樹葉總黃酮體外抗氧化活性進行了檢測，并考察了其EC50，結果證實了烏飯樹葉黃酮是一種良好的天然抗氧化劑，為烏飯樹在保健食品、藥品領域中的開發利用提供理論依據。

［1］陳重明，張 寧，王 鳴.烏飯樹的民族植物學［J］.植物資源與環境，1998，7(1):45.

［2］南京新醫學院.中藥大辭典(下)［M］上海:上海人民出版社，1974:652.

［3］國家中醫藥管理局中華本草編委會.中華本草(精華本)［M］.上海:上海科技出版社，1998:1472.

［4］屠鵬飛，胡迎慶，劉江云.越桔屬植物的化學成分與開發應用價值［J］.中草藥，1996，27(9):565-568.

［5］Cheng Chong-Ming.Ethnobotany ofthe Blackrice Tree(Vaccinium bracteaiumThunb.)［C］.The first international congress of ethnobiology，Proceedings ofethnobiology:Implications and applications［J］.Belem Press，1998:178-181.

［6］Connor A M.Variability in antioxidant activity in blueberry，and correlations among different antioxidant activity assays［J］.J Am Soc Hortic Sci，2002，127(2):238-244.

［7］Pinhero R G，Paliyath G.Antioxidant and calmodulin-inhibitory activities ofphenolic components in fruit wines and its biotechnological implications［J］.FoodBiotechnol，2001，15(3):179-192.

［8］王 立，姚惠源.烏飯樹樹葉的黃酮類成分研究［J］.天然產物研究與開發，2007，19(6):989-990.

［9］李增亮，張 琳，田景奎，等.烏飯樹葉的化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(18):2087-2089.

［10］王 立，姚惠源，陶冠軍，等.烏飯樹樹葉中槲皮素的提取分離與鑒定［J］.食品與生物技術學報，2005，24(4):89-91.

［11］王 立，姚惠源，陳正行.烏飯樹樹葉中黃酮類物質的分離、純化及結構鑒定［J］.林產化學與工業，2007，27(3):122，124.

［12］王 立，姚惠源，陶冠軍，等.烏飯樹樹葉中黃酮類色素的抗氧化活性［J］.食品與生物技術學報，2006，25(4):82-84，88.

［13］王 立，姚惠源，陶冠軍，等.烏飯樹樹葉中黃酮類色素的抗氧化活性［J］.食品與生物技術學報，2006，25(4):82-84，88.

［14］魏國華，劉鐘棟，許新德，等.烏飯樹葉提取物的抗氧化能力探討［J］.食品與發酵工業，2006，32(12):57-59.

［15］GRICE H C.Safety evaluation of butylated hydroxyanisole from the perspective of effects on forestomach and oesophageal squamous epithelium［J］.Food and Chemical Toxicology，1988，26(8):717-723.

［16］María I.Gil，Francisco A.Tomá_Barberán，Betty Hess_Pierce，Deirdre M.Holcroft，and Adel A.Kader，Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and pressing［J］.J Agric Food Chem，2000，48:4561-4569.

［17］郝曉麗，許申鴻，杭 瑚，等.用兩種方法評價四種食品抗氧化劑的抗氧化活性［J］.食品化學，2003，24(2)127-129.

［18］Bors S W，Van Beek T A.Screening of plant extract for antioxidant activity，a comparative study on three testing methods［J］.Photochemi Anal，2002，13(1):8.