纖維素酶法提取斷血流皂苷的工藝研究

劉麗敏， 年四輝， 吳海振

(1.安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，安徽蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽蕪湖 241002)

斷血流為唇形科植物蔭風(fēng)輪Clinopodium polycephalum(Vaniot)c.Y.wu et Hsuan或風(fēng)輪菜Clinopodium chinensis(Benth.)O.Kuntze的干燥地上部分，具有止血之功，常用于崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血、創(chuàng)傷出血、子宮肌瘤出血等的治療［1］，化學(xué)成分主要包括皂苷、黃酮、氨基酸、多糖、酚性成分和揮發(fā)油等成分［2－3］，斷血流總皂苷是其發(fā)揮止血作用的主要成分，但斷血流皂苷在藥材中含量較低，因此總皂苷的提取率是影響制劑療效的重要因素。近年來，纖維素酶逐漸應(yīng)用于植物藥有效成分的提取以促進(jìn)有效成分的溶出［4］。在本提取工藝中，利用纖維素酶對斷血流藥材預(yù)先進(jìn)行酶解，破壞藥材細(xì)胞壁，有助于有效成分溶出，然后用水提取，通過對不同酶解條件下斷血流皂苷A定量分析，優(yōu)選出斷血流最佳酶解反應(yīng)條件，以期對斷血流提取工藝創(chuàng)新提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 斷血流 (購于安徽省亳州中藥材市場，經(jīng)鑒定為蔭風(fēng)輪的地上部分);纖維素酶(棗莊杰諾生物酶制劑公司，活力單位20000 U/g);斷血流皂苷A(中國藥品生物制品檢定所，批號110782－200301);LC－20A高效液相色譜儀(日本島津);KQ5200B超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，水為樂百氏純凈水，甲醇為色譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素酶的配制 取纖維素酶適量，置研缽中研成細(xì)粉，精密稱取纖維素酶1.005 g至25 mL量瓶中，加純凈水配制成804 U/mL酶制劑，4℃保存，用前搖勻。

1.2.2 樣品處理 精密取斷血流粗粉10 g，加入甲醇100 mL，超聲提取30 min，過濾，濾渣續(xù)加100 mL甲醇，超聲提取30 min，過濾，合并濾液，回收甲醇至稠膏狀，石油醚200 mL分次萃取至萃取液色明顯變淡為止，甲醇溶解，定容于50 mL量瓶中，0.45 μm濾膜過濾，按1.2.5項(xiàng)下測定斷血流皂苷A含量，測得斷血流藥材中斷血流皂苷A的積分面積為566233，皂苷A在藥材中的含量為0.024%。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)及提取工藝流程 由于酶反應(yīng)速度受酶用量、溫度、酶解時間、體系pH影響較大，實(shí)驗(yàn)擬對纖維素酶提取的這4個因素參數(shù)進(jìn)行探討，按表1設(shè)計實(shí)驗(yàn):在pH5.0、溫度60℃、酶解30 min、酶加入量15 U/g為基礎(chǔ)條件下，分別改變這4個因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，pH與酶解時間是5個水平，酶解溫度與酶用量為6個水平，提取液pH通過醋酸－醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié);酶用量采用每克生藥所消耗的酶單位表示(U/g)。

稱取斷血流粗粉40 g，10倍量水提取，按各設(shè)計單因素條件酶解后，微沸加熱1 h，過濾，續(xù)加400 mL水，微沸加熱1 h，過濾，合并濾液，取相當(dāng)于2 g生藥量的藥液，減壓濃縮至干，甲醇分次溶解定容于10 mL量瓶中，0.45 μm濾膜過濾，按1.2.5項(xiàng)下測定斷血流皂苷A含量，以斷血流皂苷A含量作為評價指標(biāo)(下同)。

斷血流皂苷A含量=(斷血流皂苷A質(zhì)量/藥材質(zhì)量)×100%

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)方法 在單因素實(shí)驗(yàn)中固定其他三個因素，只對一個因素進(jìn)行考察，沒有考慮到其他各個因素的相互影響，為對各因素綜合考察，故在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取酶解pH(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)、酶用量(D)4個因素、每個因素設(shè)3個水平進(jìn)行考察，因素水平見表1。按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，1.2.3項(xiàng)下進(jìn)行工藝提取、含量測定。

表1 正交因素水平

1.2.5 斷血流皂苷A標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［5］色譜條件:LichrospherC18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，測定波長:250 nm，流動相:甲醇－水(80:20)，流速:1 mL/min，柱溫:25 ℃，進(jìn)樣量:10 μL。

精密稱取五氧化二磷中干燥至恒重的斷血流皂苷A 5.08 mg，甲醇溶解并定容于25 mL量瓶中，從中分別移取0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，分別配制成 2.03、10.16、20.33、40.66、81.31、162.62 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μL，于波長250 nm處測定，得線性回歸方程Y=11 778X+97.169，R2=0.999 8，斷血流皂苷A在2.03～162.62 μg/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系。加樣回收試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)均符合要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對斷血流皂苷A提取率的影響 由圖1可以看出，隨著溶液pH增大，斷血流皂苷A的提取率逐漸增大，在pH為6.0時斷血流皂苷A峰積分面積最大，表明提取率達(dá)到最大值，之后隨著pH值的繼續(xù)增加，斷血流皂苷A提取率降低，故最佳pH為6.0。

圖1 pH對斷血流皂苷A溶出的影響

2.2 酶解溫度對斷血流皂苷A提取率的影響 由圖2可以看出，在溫度為60℃時斷血流皂苷A峰積分面積最大，表明提取率達(dá)到最大值，隨著溫度繼續(xù)升高，提取率急劇下降，蓋因溫度升高可以增加纖維素酶的活性，但溫度過高會導(dǎo)致酶失活，所以酶解溫度在60℃較為適宜。

圖2 溫度對斷血流皂苷A溶出的影響

2.3 酶解時間對斷血流皂苷A提取率的影響 由圖3可以看出，隨著酶解時間的增加，斷血流皂苷A的提取率也在增加，酶解時間為40 min時斷血流皂苷A的提取率達(dá)到最大值，隨后增加酶解時間反而提取率下降，故酶解時間為40 min。

圖3 酶解時間對斷血流皂苷A溶出的影響

2.4 酶用量對斷血流皂苷A提取率的影響 由圖4可以看出開始隨著酶用量的增加斷血流皂苷A的提取率也在增加，在用量為15 U/g時提取率達(dá)到最大值，進(jìn)一步增加酶用量，皂苷A提取率下降明顯，故定為酶用量為15 U/g。

圖4 酶用量對斷血流皂苷A溶出的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表明，斷血流皂苷A的提取率極差大小B＞A＞D＞C，較好的工藝組合為A3B2C2D1。方差分析結(jié)果表明，因素B酶解溫度在α=0.1水平上影響顯著，因素A酶解pH在α=0.25水平上影響顯著，因素C酶解時間、D酶用量影響較小，所以最佳酶提取條件為:酶解 pH 7、溫度60℃、酶用量5 U/g、酶解時間40 min。見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及直觀分析

表4 方差分析

2.6 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 稱取斷血流粗粉40 g 3份，量取400 mL pH7.0的水，60℃溫度下加入5 U/g纖維素酶，酶解40 min后，微沸提取1 h，過濾，續(xù)加400 mL水，微沸加熱1 h，過濾，合并濾液，取相當(dāng)于2 g生藥量的藥液，減壓濃縮至干，甲醇分次溶解定容于10 mL量瓶中，0.45 μm濾膜過濾，按1.2.5項(xiàng)下測定斷血流皂苷A含量，得斷血流皂苷A平均積分面積為514829，斷血流皂苷A含量為0.021 8%，提取率為90.92%;另取斷血流粉40 g 3份，不經(jīng)酶解直接提取，得斷血流皂苷A平均積分面積為412149，斷血流皂苷A含量為0.017 5%，斷血流皂苷A平均提取率為72.79%，經(jīng)過酶解處理斷血流皂苷A提取率可以提高18.13%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要是以斷血流皂苷A作為指標(biāo)檢測酶解的作用效果，研究酶解提取法工藝的目的在于尋求最適的酶作用條件，以發(fā)揮酶的最大催化效果，使細(xì)胞壁降解形成更疏散的結(jié)構(gòu)，同時還要有效保證藥效成分的穩(wěn)定，達(dá)到最高的提取收率。以斷血流皂苷A提取率為評價指標(biāo)能顯示出斷血流有效成分總皂苷的酶解提取效果。

單因素實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件pH為6.0、酶解溫度60℃、酶解時間40 min、酶用量為15 U/g，與正交實(shí)驗(yàn)最佳水平pH7.0、酶解溫度60℃、酶解40 min、酶用量為5 U/g有所矛盾，但因單因素實(shí)驗(yàn)是固定其他因素只對一個因素考察，沒有考慮到各個因素間的交互作用，故正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定為最佳酶解條件。

纖維素酶通過降解植物細(xì)胞壁中纖維素的結(jié)構(gòu)從而促進(jìn)植物細(xì)胞中化學(xué)成分的溶出，其機(jī)理主要是裂解纖維素單元糖與糖之間的1→6位的連接，但對于苷類成分來說，糖鏈中的糖與糖、糖與苷元之間的連接有時也會出現(xiàn)1→6位連接，我們在使用纖維素酶的時要慎重，以免對目標(biāo)成分造成破壞。本實(shí)驗(yàn)單因素實(shí)驗(yàn)中，隨著酶用量的增加，斷血流皂苷A提取率降幅較大，是否對斷血流皂苷A結(jié)構(gòu)造成破壞還有待進(jìn)一步研究。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:267.

［2］遲海東，路金才.風(fēng)輪菜屬藥用植物研究進(jìn)展［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，23(2):123－128.

［3］程 霞，陳國廣，石紹華.止血中草藥斷血流研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)藥，2007，11(5):454－456.

［4］王劍文，許云峰，周建芹，等.酶法輔助強(qiáng)化中藥提取過程研究進(jìn)展［J］.生物加工過程，2008，6(6):6－11.

［5］陳華國，陳 慶，靳鳳云.HPLC法測定斷血流中斷血流皂苷的含量［J］. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，28(3):62－63.