HPLC-ELSD法測定希明婷片中27-脫氧升麻亭的含量

陳 麗， 程屹俊， 梁瓊麟， 王義明， 由春娜， 董 敏， 羅國安，3*

(江西中醫學院藥學系，江西南昌 330004;2.清華大學中藥現代化研究中心，北京 100084;3.華東理工大學中藥現代化工程中心，上海 200237;4.北京北大維信生物科技有限公司，北京 100080;5.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺 264003)

希明婷片是由升麻總皂苷經輔料加工而成，主要用于女 性圍絕經期綜合征，改善烘熱汗出，煩躁易怒等癥狀［1-2］。文獻報道升麻中三萜皂苷具有調節內分泌的作用［3］，Erdal Bedir和Ikhlas A.Khan從升麻中分離出27-脫氧升麻亭［4］。故本實驗選擇以三萜皂苷中的27-脫氧升麻亭為指標成分控制希明婷片的質量。

目前，紫外檢測器(UVD)、示差折光檢測器(RID)、蒸發光散射檢測器(ELSD)、質譜檢測器(MSD)是檢測中藥成分質量常用的4種檢測器，其中紫外檢測器只能用于有紫外吸收的物質的分析，其余3種檢測器均為通用型檢測器，可用于未知物、糖類、脂肪烴、其他無紫外吸收物質等的分析。3種通用型檢測器中，RID和ELSD與MSD相比，因價格更便宜，應用相對更廣。27-脫氧升麻亭為無紫外吸收物質，可采用常用的通用型檢測器(RID、ELSD、MSD)進行檢測，因MSD昂貴，不宜采用。文獻［5］中有報道采用示差折光檢測器測定升麻藥材中27-脫氧升麻亭的質量，但未曾見采用蒸發光散射檢測器法測定。本實驗建立了采用HPLC-ELSD法測定希明婷片中27-脫氧升麻亭的含量的方法，并比較了ELSD和RID兩種檢測器對測定27-脫氧升麻亭的影響。

1 材料和試藥

0.45 μm微孔濾膜;資生堂 MG C18柱;乙腈(色譜純，fisher公司)，超純水(Milli Q Synthesis超純水純化系統制，過0.2 μm微孔濾膜)。無水甲醇(分析純，北京化工廠生產);27-脫氧升麻亭標準品(山東綠葉制藥有限公司提供);希明婷片(山東綠葉制藥有限公司，批號:20070329、20071143、20081234、20090742)。

BS110S電子天平(d=0.1 mg，賽多利斯公司);XP205型電子天平(d=0.01 mg，梅特勒托利多公司);Agilent 1200系列高效液相色譜儀(配備Alltech N2000蒸發光散射檢測器，N2000色譜數據工作站);KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率 40 KHz);MilliQSynthesis超純水純化系統。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 資生堂MG C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相:水-乙腈梯度洗脫(見表1)，流速:1 mL/min，柱溫:30℃，氣體(氮氣)流速:2.9 L/min，漂移管溫度:115℃。對照品溶液和供試品溶液各20 μL。理論塔板數以27-脫氧升麻亭峰計不低于5 000。結果見圖1～2。

表1 梯度條件

2.2 希明婷片供試品溶液的制備 取10片希明婷片，研細后，取200 mg希明婷片粉末，精密稱定。置25 mL量瓶中，量取20 mL甲醇，超聲溶解30 min后，甲醇定容至刻度。過0.45 μm微孔濾膜，所得濾液即為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備 稱取對照品27-脫氧升麻亭6.70 mg，甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，得對照品溶液。

圖1 27-脫氧升麻亭的HPLC-ELSD圖譜

圖2 希明婷片的HPLC-ELSD圖譜

2.4 線性關系考察 分別精密量取1.5、1.25、0.75、0.45、0.25 mL的對照品溶液至2 mL量瓶中，甲醇稀釋定容，即得6個不同濃度的對照品溶液。按2.1項下的色譜條件測定，以對照品進樣量的對數值為橫坐標，以峰面積值的對數值為縱坐標，進行回歸，標準曲線為:Y=1.445 4X+4.961，r2=0.999 7，其線性范圍為1.67 ～13.40 μg。

2.5 最低檢測限及定量限試驗 采用信噪比法檢測27-脫氧升麻亭的檢出限及定量限。以信噪比為3:1時相應濃度確定其檢測限，以信噪比大于或等于10:1且能準確定量時的相應濃度確定其定量限。

將27-脫氧升麻亭對照品溶液稀釋一定倍數，進樣20 μL，得到27-脫氧升麻亭的檢出限及定量限，檢測限為:0.100 μg，定量限為:0.904 μg。

2.6 精密度實驗 取1個27-脫氧升麻亭對照品溶液分別連續進樣6次及6日內每日進樣一次，分別計算6次所測的組分峰面積及相對標準偏差(RSD%)，日內精密度的RSD為4.18%，日間精密度的RSD為4.71%。結果表明該儀器精密度良好。

2.7 穩定性實驗 取同一份供試品溶液，分別于0、3、6、20、22、24 h不同時間間隔點進樣分析，對峰面積進行考察，峰面積的RSD為3.43%。結果顯示樣品溶液至少在24 h穩定。

2.8 重復性實驗 取同一批希明婷片(批號20090742，每片的平均重量為101.93 mg)，按供試品溶液制備方法制備6份，每份樣品進樣2針，每針進樣量20 μL。以分別計算27-脫氧升麻亭的含量(外標兩點對數方程計算)及RSD(%)，結果其平均含量為2.61%，RSD為4.94%，表明該方法重現性良好。

2.9 加樣回收率實驗 取同一批希明婷片(批號:20090742)，按2.2項供試品溶液的制備方法，平行制備9份樣品，每 3份樣品分別加入高(120%)、中(100%)、低(80%)3個不同每個樣品按照2.1項色譜條件，分別測定其色譜圖，計算其27-脫氧升麻亭的加樣回收率，結果表明平均加樣回收率為102.20%，RSD為2.68%(n=9)，說明該方法準確度良好(見表2)。

表2 27-脫氧升麻亭的加樣回收率實驗結果

2.10 樣品測定 取3批希明婷片，按2.2項供試品溶液制備方法制備。按2.1項下的色譜條件分析對照品溶液和供試品溶液，每批希明婷片重復測定3次，按外標法計算各樣品中27-脫氧升麻亭的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 供試品溶液的制備 采用不同濃度的甲醇溶解升麻總皂苷提取物，結果發現，升麻總皂苷提取物在甲醇中溶解最好。此外，采用甲醇超聲溶解希明婷片粉末10 min、20 min、30 min、45 min，發現甲醇超聲溶解30 min后，升麻總皂苷即提取完全。

3.2 檢測器的選擇 本研究預實驗比較了RID和ELSD在相同色譜條件下(等度洗脫:乙腈-水=40:60)分析樣品時所得色譜圖，見圖3和圖4。結果顯示，ELSD所得圖譜基線更穩定、噪音干擾更小;而且，ELSD的檢測沒有流動相的限制且可以梯度洗脫，因而本實驗采用ELSD作為27-脫氧升麻亭含量測定的檢測器。

3.3 洗脫梯度及色譜柱的選擇 采用不同等度洗脫和梯度洗脫條件分析樣品時，等度洗脫雖然分析時間短，但27-脫氧升麻亭和相鄰峰的分離情況對色譜柱的耐用性差，故最終確定表1中所列洗脫梯度為最終洗脫梯度。在該洗脫梯度下，27脫氧升麻亭的峰形和分離度都較好，且采用Agilent C18柱、Phenomenex C18柱、Agela C18柱等色譜柱在相同色譜條件下分析樣品時27-脫氧升麻亭均獲得較好的分離。且樣品溶液中其它色譜峰的峰形和分離度也較好，為希明婷片其它成分的定量提供參考方法。

圖3 等度洗脫下HPLC-RID的色譜圖(1為27-脫氧升麻亭)

圖4 等度洗脫下HPLC-ELSD的色譜圖(1為27-脫氧升麻亭)

從研究分析結果顯示，通過該方法不僅可對希明婷片中的活性成分的含量進行控制，同時也為測定希明婷片中其它成分的含量，提高希明婷片的質量標準提供了參考。

［1］劉培淑，李 霞，劉 媛，等.希明婷片治療女性圍絕經期綜合征的臨床研究［J］.山東大學學報，2008，46(8):791-794.

［2］方超英，徐漪舟，張西芝，等.希明婷片治療女性圍絕經期綜合征的臨床觀察［J］.中國婦幼保健，2009，24(6):838-840.

［3］周 亮，楊峻山.升麻族植物中的三萜皂苷［J］.國外醫藥·植物藥冊，2005，20(4):149-156.

［4］Bedir E，Khan I A.Cimiracemoside A:A New Cyclolanostanol Xyloside from the Rhizome of Cimicifuga racemosa［J］.Chem Pharm Bull，2000，48(3):425-427.

［5］潘瑞樂，陳迪華，斯建勇，等.反相高效液相色譜法測定不同品種升麻中27-脫氧升麻亭的含量［J］.中南藥學，2007，5(3):206-208.