姜黃素對人鼻咽癌CNE-2Z細胞侵襲和轉移的體外實驗研究

范德生 李澤民 孫寧

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院病理科，上海 200021；2.廣東醫學院病理學教研室，廣東 東莞 523808

姜黃素對人鼻咽癌CNE-2Z細胞侵襲和轉移的體外實驗研究

范德生1李澤民1孫寧2

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院病理科，上海 200021；2.廣東醫學院病理學教研室，廣東 東莞 523808

背景與目的：鼻咽癌放射治療后的局部復發和遠處轉移是患者死亡的主要原因之一。姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃(Curcuma longa)根莖中提取的一種酚性色素，具有抗菌、抗腫瘤及抗氧化作用。本研究旨在探討姜黃素對人鼻咽癌CNE-2Z細胞侵襲和轉移的影響，并探討其可能的機制。方法：以10、20、40和80 μmol/L姜黃素分別處理CNE-2Z細胞24、48 h后，MTT法檢測其對細胞的生長抑制作用。應用Transwell小室進行人工重組基底膜(matrigel)侵襲和運動實驗，觀察姜黃素對CNE-2Z細胞侵襲和轉移的影響。RT-PCR和Western blot分別檢測不同濃度姜黃素作用后細胞中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)表達水平的變化。結果：應用姜黃素處理后，人鼻咽癌CNE-2Z細胞生長受到抑制，且作用呈時效-量效依賴關系；同時細胞侵襲和遷移能力明顯降低；EGFR基因和蛋白表達亦明顯減弱。結論：姜黃素能夠減弱人鼻咽癌CNE-2Z細胞的體外侵襲和轉移能力，其機制可能與降低EGFR的表達有關。

鼻咽癌； 姜黃素； 侵襲； 轉移

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)多發于廣東珠江三角洲地區及兩廣西江流域，俗稱“廣東瘤”。鼻咽癌生長位置深并有重要神經血管相鄰，不易發現且不易手術切除。90%左右的鼻咽癌為未分化型非角化性癌，對放射線殺傷較敏感，因而放射治療是鼻咽癌首選治療手段，但仍有40%～60%鼻咽癌患者死于鼻咽或頸部復發和(或)遠處器官轉移。姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃(Curcuma longa)根莖中提取的一種酚性色素，具有抗腫瘤［1］、抗氧化［2］、抗炎［3］、抑制血管生成［4］及調節多藥耐藥基因［5］的作用。近年來，有研究證實姜黃素能夠減少腫瘤細胞體內及體外的侵襲和轉移［6-7］。本研究觀察了姜黃素對人鼻咽癌CNE-2Z細胞侵襲轉移能力的影響，并通過檢測與侵襲轉移密切相關的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)表達的變化，探討姜黃素影響鼻咽癌細胞侵襲轉移的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人低分化鼻咽癌細胞系CNE-2Z細胞由廣東醫學院病理學教研室分離并保存。其他藥品和試劑包括：姜黃素(綠天公司，杭州)，RPMI-1640培養液(Gibco，美國)，新生小牛血清(四季青生物材料工程公司，杭州)，四甲基偶氮唑藍(MTT) (Sigma，美國)，細胞總RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒(Tiangen公司，北京)，鼠抗人EGFR單克隆抗體(Santa Cruz，美國)，兔抗人β-actin多克隆抗體，HRP標記羊抗鼠IgG (H+L)(中杉生物技術有限公司，北京)，人工重組基底膜Matrigel膠(Sigma，美國)，Tanswell Chamber (8 μm孔徑，Costar，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

CNE-2Z細胞置于RPMI-1640培養液中(含10%新生小牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，0.056% NaHCO3，調節pH值至7.4)，于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱內常規培養，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 姜黃素對細胞增殖的抑制作用

取對數生長期細胞，調整到所需細胞濃度，接種于96孔培養板(每孔150 μL)，按不同實驗設計將培養液換成空白對照液和不同濃度的姜黃素溶液(10、20、40及80 μmol/L)，分別培養24 h或48 h。

每孔加入MTT 50 μL (濃度為5 mg/mL)，于37 ℃培養箱內溫育4 h后終止。吸棄各培養孔內上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩搖勻后在全自動酶標儀上波長490 nm處測各孔吸光度(D)值，不同濃度的姜黃素對腫瘤細胞增殖的毒性以抑制率，計算公式為：細胞抑制率(%)=(D對照組-D實驗組)/D對照組×100%。

1.2.3 細胞體外侵襲實驗

取指數生長期的各組不同濃度姜黃素處理的細胞，Trypsin-EDTA消化制備細胞懸液，臺盼藍染色做活細胞計數，用RPMI-1640(含1%小牛血清)洗滌1次，然后用RPMI-1640 (含1%小牛血清)稀釋制備5.0×105mL-1的細胞懸液。Matrigel?置于冰上放置8 h，用預冷至0 ℃的無菌三蒸水稀釋Matrigel?至200 μg/mL。稀釋后的Matrigel?每孔按50 μL鋪入Transwell?上室，置于超凈工作臺過夜風干。臨用前在Transwell?上室中加入無血清RPMI-1640培養液每孔100 μL，預溫至37 ℃，室溫100 r/min振搖90 min后，吸去液體以去除未結合的Matrigel?。細胞懸液按每孔100 μL加入Transwell?，每組2孔；Transwell?下室加入RPMI-1640 (含10 μg/mL Fibronectin、10%小牛血清)600 μL。棄去孔內培養液，加入甲醇和丙酮(1∶1)固定10 min。以PBS浸濕的棉簽拭去聚碳酸酯濾膜正面(靠近上室面)的細胞。蘇木精染色3 min，水洗，伊紅染色10 s，水洗，中性樹膠封片。于200倍顯微鏡下計數穿過PVPF濾膜的細胞數。每膜計數上、下、左、右、中5個隨機不同視野，以每視野細胞平均數代表侵襲能力，每組平行設3個濾膜。

1.2.4 細胞運動實驗

細胞運動實驗中Transwell?上室的聚碳酸酯濾膜不鋪設Matrigel?，其余步驟與細胞侵襲實驗相同，實驗重復3次。

1.2.5 RT-PCR檢測

收集不同濃度姜黃素(0、10、20和40 μmol/L)作用細胞24 h，使用細胞總RNA提取試劑盒提取培養細胞總RNA，采用一步法進行RT-PCR反應，以GAPDH為內參照。參照GenBank數據庫，采用Oligo計算機軟件設計引物，由上海生工生物技術公司合成。E G F R上游引物：5’-GTGGCTGGTTATGTCCTCA-3’， 下游引物：5’-CAGTTTCTGGCAGTTCTCCT-3’，擴增產物3 7 7 b p；G A P D H上游引物：5’-GCATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物：5’-TGGGTGAGGAGGTGGAAA-3’，擴增產物858 bp；反應條件：50 ℃逆轉錄30 min，94 ℃逆轉錄失活5 min，然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環，72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR產物加入1 μL的6×Loading Buffer，進行1%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 μg/mL的EB)，電泳緩沖液為1×TAE，在50 V電壓下電泳30 min，紫外燈下觀察結果。凝膠成像系統攝像并分析，以EGFR與GAPDH擴增條帶的峰面積比值進行mRNA水平的相對定量。

1.2.6 Western blot 分析

用預冷的PBS洗細胞2次，然后加細胞裂解液冰上放置20 min，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液定量分析。取已定量的總蛋白進行12% SDS-PAGE實驗，電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入1∶500稀釋的鼠抗人EGFR單克隆抗體，室溫溫育3 h，TBS洗滌后加入稀釋度1∶4 000的HRP標記羊抗鼠IgG(H+L)，室溫溫育90 min；TBS洗滌后經化學發光試劑溫育，暗室X片曝光顯示實驗結果。

1.2.7 統計學處理

實驗數據用表示，實驗結果選用單因素方差分析，數據資料采用統計學軟件SPSS 12.0處理。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度姜黃素對CNE-2Z細胞增殖的影響

不同濃度姜黃素可以不同程度地抑制細胞增殖，同一時間點各實驗組細胞抑制率相比較差異有統計學意義，且抑制率與姜黃素濃度呈明顯的劑量效應關系(圖1)。同時在40、80 μmo/L姜黃素作用細胞24 h后，在倒置顯微鏡下觀察到細胞輪廓模糊，細胞質空泡和顆粒增多，不規則細胞增多，并見大量細胞脫落，培養液中出現很多的懸浮細胞碎片，表明高濃度姜黃素不僅抑制細胞的增殖，還可能有細胞毒作用，可以直接殺傷CNE-2Z細胞。

2.2 姜黃素對CNE-2Z細胞侵襲、運動能力的影響

Transwell體外侵襲和運動實驗，以24 h穿過人工重組基底膜到達聚碳酸酯濾膜的細胞數表示細胞侵襲和運動能力的大小。結果顯示姜黃素能抑制CNE-2Z細胞的侵襲、運動能力，與未加姜黃素的對照組細胞數比較，差異具有統計學意義(P＜0.001，表1)。

表 1 不同濃度姜黃素對CNE-2Z細胞侵襲和運動能力的影響Tab. 1 Effect of different concentrations of curcumin on invasion and migration of CNE-2Z cells(n, ±s)

表 1 不同濃度姜黃素對CNE-2Z細胞侵襲和運動能力的影響Tab. 1 Effect of different concentrations of curcumin on invasion and migration of CNE-2Z cells(n, ±s)

*: Compared with the control group, P＜0.001(P=0.000, respectively).

Curcumin concentration/μmol·L?1 Invasion Migration 0 (control) 67.67±7.234 95.67±2.309 10 54.33±4.041* 82.00±6.000*20 46.00±4.000* 65.69±5.686*40 34.67±3.786* 60.64±2.082*

2.3 姜黃素對CNE-2Z細胞EGFR mRNA及蛋白表達的影響

本實驗RT-PCR結果顯示，各組細胞均有EGFR mRNA的表達，擴增電泳帶約在377 bp處，對其進行光密度掃描半定量分析結果顯示，CNE-2Z細胞在不同濃度姜黃素處理24 h后，EGFR mRNA的表達有不同程度的減少，隨姜黃素濃度的升高呈現逐漸降低的趨勢，各組間比較差異均有統計學意義(P＜0.001，圖2)。Western blot結果顯示，不同濃度姜黃素處理細胞24 h后，EGFR蛋白的表達亦有不同程度的減少(圖3)。

3 討 論

近年來，植物來源的藥物越來越受到重視，從天然植物中尋找高效、低毒的抗腫瘤新藥，是腫瘤治療研究領域中的重要課題。Kuttan等［8］通過對姜黃提取物和姜黃素的研究發現，姜黃素能明顯抑制CHO細胞的生長，具有抗腫瘤特性。許多體內外實驗已經證實，姜黃素具有確切的抗腫瘤活性［9-10］。本實驗觀察到，在10～80 μmol/L濃度范圍內，姜黃素在作用24 h和48 h后均可抑制CNE-2Z細胞的增殖，且隨濃度的增加其抑制率呈現增長的趨勢，同一時間點各實驗組細胞抑制率相比較，差異有統計學意義。

浸潤和轉移是惡性腫瘤最基本和最重要的生物學特性之一，腫瘤轉移是一個多步驟、多階段、多基因參與的復雜過程， 從分子水平可將這個過程分為三步，即黏附、降解、運動。因此，具有抗黏附、抗運動或抗侵襲降解作用的化合物均可抑制惡性細胞的轉移行為。1995年，Menon等［11］報道姜黃素可抑制高轉移鼠黑色素瘤細胞B16 F10在小鼠體內的肺轉移，使肺臟腫瘤結節明顯減少，生存期延長。2001年，沈曉鳴等［12］證實姜黃素對人肺癌細胞的體外侵襲、運動能力有抑制作用。本實驗以CNE-2Z細胞為觀察對象，獲得了姜黃素對CNE-2Z細胞株侵襲、運動影響的較為直接的證據。

表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是一種小分子多肽，EGF作為一種配體與細胞膜上的EGFR結合，改變受體的三維構象，使之二聚體化，進而可激活眾多的下游信號路徑，包括PLCC、PI3K、小G蛋白、P21ras、rasGTP酶激活蛋白(GAP)、生長因子受體結合蛋白2 (grb2) 和src激酶家族等，其中研究較明確的主要有兩條途徑：一條是ras-raf-MEK-erk/MAPK途徑；另一條是PI3K-PKCIKK途徑，使IJBA磷酸化后導致NFJB移位至核內，而將信息傳遞入核，該途徑與細胞移動性的增強有關。研究發現，MAPK途徑在癌細胞移動過程早期起作用，PKC途徑在癌細胞移動過程晚期起作用，EGFR的過表達能通過激活PKC途徑來補償MAPK途徑的損失，從而在腫瘤的侵襲和轉移中起重要作用。

EGFR是EGF的唯一受體，越來越多的研究證實EGFR的高表達與細胞惡變、腫瘤的增殖、轉移和腫瘤血管形成等相關。姚運紅等［13］研究發現，不同轉移能力及途徑的腫瘤細胞的EGFR表達不一，但同一轉移能力和途徑的腫瘤細胞EGFR的表達存在一致性，說明EGFR表達強弱能反映腫瘤細胞的轉移能力，并提示在同一腫瘤細胞群體中，可能存在某些既能控制腫瘤生長，又能控制腫瘤轉移的同源基因。但目前對EGFR過量表達增強腫瘤轉移的機理還了解甚少。曾方銀等［14］研究發現腫瘤細胞中EGFR過量表達增強了腫瘤細胞對胞外基質的黏附作用，從而促進了腫瘤細胞分解基底膜和遠端轉移。肌動蛋白(actin)修飾蛋白的動員是EGFR介導的遷移反應所必需的，EGF與EGFR 結合后，可以激活細胞骨架，通過對細胞骨架重構、黏附、移動、表達和蛋白酶的的活化等多種途徑影響腫瘤的轉移性［15］。

多種不同的EGFR信號傳遞抑制劑，如：IMC C225、ZD1839和OSI2774在體內外實驗均顯示了抗癌活性，并在初步的臨床試驗中取得了令人振奮的結果。以EGFR為靶點的抗腫瘤治療有特異、廣譜、高效的特點，已成為癌癥治療的成功領域之一。本實結果顯示：CNE-2Z細胞在不同濃度姜黃素處理24 h后EGFR mRNA和蛋白的表達均有不同程度的減少，隨著姜黃素濃度的升高呈現逐漸降低的趨勢。這表明姜黃素有可能通過抑制EGFR的表達來抑制CNE-2Z細胞的增殖和侵襲轉移。

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Effects of curcumin on invasion and metastasis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells

FAN De-sheng, LI Ze-min, SUN Ning(Department of Pathology, Shuguang Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200021, China)

SUN Ning E-mail：hellen4099@126.com

Background and purpose：The main causes of nasopharyngeal carcinoma patient’s death are loco-regional recurrence and distant metastasis after radiation therapy. Curcumin, a natural compound extracted from rhizomes of curcuma species, has been shown to possess potent anti-inflammatory, anti-tumor and anti-oxidative properties. This study aimed to explore the effects of curcumin on invasion and metastasis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells and to investigate the possible mechanism.Methods：CNE-2Z cells were treated with 10, 20,40 and 80 μmol/L curcumin for 24 and 48 h, respectively. Proliferation of cells was measured by MTT assay. Invasion and metastasis of cells were evaluated with Transwell chamber. The expression of epidermal growth factor receptor(EGFR) was detected by RT-PCR and Western blot.Results：After being treated with curcumin, the proliferation of CNE-2Z cells was inhibited in a time and dose-depending manner, the invasion and metastasis of cells were also inhibited, and the expression level of EGFR was decreased.Conclusion：Curcumin could decrease the invasion and metastasis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells possibly by inhibiting the expression of EGFR.

Nasopharyngeal carcinoma; Curcumin; Invasion; Metastasis

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.006

R739.63

A

1007-3639(2011)06-0452-05

廣東省教育廳自然科學研究項目(No：GK0404)。

孫寧 E-mail:hellen4099@126.com

2011-01-12

2011-05-20）