細柱五加葉中抗HMGB1總三萜活性物質的閃式提取工藝

劉向前 ，鄭禮勝，翁柳娜，鄒方卉，李麗麗

(1. 中南大學 化學化工學院，湖南 長沙，410083；2. 湖南中醫藥大學 藥學院，湖南 長沙，410208)

五加科五加屬植物大都具有很強和廣泛的藥食用價值，如滋補、抗風濕、抗應激、抗疲勞、抗腫瘤等作用，中、日、韓三國都已把它列入各自國家的藥典中，臨床用于治療風濕痹痛、腰膝軟弱等病癥[1-6]。倪娜等[6-7]對細柱五加葉中的三萜類成分進行了系統研究，分離出了多個lupane型三萜成分，并對它們進行了抗 HMGB1活性篩選，結果顯示，五加苷元acankoreanogenin A和五加皂苷acankoreoside A均有較強的抗HMGB1活性，有望成為一種抗HMGB1新藥。二次通用旋轉試驗設計是正交回歸組合設計的一種，它克服了二次回歸預測值的方差強烈地依賴于實驗點在因子空間中的位置這個缺點，可由預測值直接尋找最優區域；采用回歸旋轉設計實驗方法，使在與實驗中心點距離相等的點上具有相同的方差，消除了回歸系數間的相關性，從而使實驗次數大大縮減，計算簡便，易于得到多因素的較優組合及變化趨勢。由于其具有準確性高、綜合性好、系統性強、信息量大等優點，被廣泛應用于生產試驗和科學試驗[8-10]。我國有豐富的細柱五加資源，為新藥開發提供了充足的資源保障，但目前尚無其葉中三萜成分的提取工藝和定量研究報道。本文作者采用閃式提取法，通過二次通用旋轉實驗設計優化其工藝，并確定了UV法測定提取物中總三萜成分含量的條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料為細柱五加葉，2008年11月采自湖南，經鑒定為細柱五加(Acanthopanax gracilistylus W. W.Smith)葉，陰干。標本存于中南大學制藥工程系標本室。

試劑為五加皂苷、五加苷元對照品，由本研究室自制，經1D和2D-NMR等光譜鑒定后，HPLC測定其含量＞99.0%，甲醇、乙醇、NaHCO3均為分析純。

儀器為：JHBE-20A型閃式提取器(北京金鼐科技有限公司生產)，752型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司生產)，TG328A型物理天平(湘儀天平儀器廠生產)，DZF-6020型真空干燥箱(上海精密儀器實驗設備有限公司生產)，202-0型電熱恒溫干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法

取細柱五加葉8.0 g，剪成小塊(直徑＜5.0 mm)，加提取劑適量，閃式提取[11-12]，抽濾，回收溶劑，濃縮，干燥，得干膏。對水分含量進行測定[1]，計算干膏得率。

采用三因子五水平二次通用旋轉實驗設計[13-14]安排實驗，所選因素及水平見表 1。實驗方案及結果見表2。

1.2.2 總三萜成分的測定

(1) 波長選擇。取五加皂苷和五加苷元對照品各10 mg，精密稱定，分別置于100 mL容量瓶中，加適量飽和NaHCO3溶液[15]，超聲溶解，定容，搖勻，得皂苷和苷元對照品的飽和 NaHCO3溶液。以飽和NaHCO3溶液為空白樣，在190～400 nm波長下掃描，皂苷和苷元最大吸收波長分別為218和214 nm。但在飽和NaHCO3溶液中皂苷比苷元更易溶解，且溶液較穩定，故選擇五加皂苷為測定用的對照品，檢測波長為218 nm。

表1 因素水平表Table 1 Factors and coded levels

(2) 對照品溶液的配制。取五加皂苷對照品 10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，飽和NaHCO3溶液溶解，定容，搖勻，即得五加皂苷對照品溶液，并測得它的紫外光譜，見圖1。

(3) 供試品溶液的配制。取1.2.1項下的樣品干膏0.1 g左右，精密稱定，加適量飽和NaHCO3溶液，超聲溶解，冷卻，定容至100 mL，并測得它的紫外光譜，見圖2。

(4) 標準曲線的繪制。分別精密移取五加皂苷對照品溶液1，2，3，4，5，6，7 mL于7只10 mL容量瓶中，飽和NaHCO3溶液定容，測定218 nm處吸光度。五加皂苷對照品溶液的標準曲線如圖3所示。

從圖3可見：在0.01～0.07 g/L范圍內，五加皂苷濃度與吸光度成線性，擬合曲線Y=12.275X+0.042 14，相關系數為R=0.999 6。

(5) 精密度實驗。取五加皂苷對照品溶液，稀釋2.5倍，以飽和NaHCO3溶液做空白樣，218 nm下測定其吸光度，重復5次；相對標準偏差RSD為0.67%，表明儀器精密度高。

(6) 重現性實驗

取表2中16號樣品5份，配制供試品溶液；以飽和NaHCO3溶液做空白樣，在波長為218 nm下分別測定其吸光度，RSD為1.22%，表明該方法可靠。

(7) 穩定性實驗。取表2中16號樣品配制供試品溶液；以飽和NaHCO3溶液做空白樣，在波長為218 nm下每隔1.5 h測量1次吸光度，共5次，RSD為0.74%，表明樣品在6 h內穩定，滿足含量檢測要求。

表2 三因素二次通用旋轉實驗設計及結果Table 2 Three-factor second order rotation combination experimental design and results

圖1 五加皂苷對照品的紫外光譜Fig.1 UV spectrum of standard acankoreoside A

(8) 加樣回收實驗。取表2中17號樣品0.05 g左右5份，精密稱定，分別加入一定量的五加皂苷標準品，配制供試品溶液；以飽和NaHCO3溶液做空白樣，218 nm下分別測定吸光度，計算總皂苷含量，并計算出回收率為98.2%，RSD為1.23%，表明該方法回收率較高。

圖2 樣品中五加皂苷的紫外光譜Fig.2 UV spectrum of acankoreoside A in sample

圖3 五加皂苷的標準曲線Fig.3 Calibration curve of acankoreoside A

(9) 總三萜成分提取率的測定。制備供試品溶液；以飽和NaHCO3溶液做空白樣，測定218 nm下各樣品的吸光度，根據標準曲線計算總三萜成分濃度；再根據干膏量，計算出總三萜成分提取率。

2 結果與分析

2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

三因素二次通用旋轉實驗設計及結果見表2。

以綜合評分Y為因變量，3因素Xi的編碼值為自變量，對實驗所得數據(見表2)進行多元分析，得回歸方程：

對上述方程及各因素的方差分析見表3。

由表 3可以看出：失擬檢驗 F1=-0.125 07＜F0.05(5,5)=5.05，差異不顯著，說明未控制因素對實驗結果干擾很小，擬合不足被否定；擬合檢驗 F2=165.301 55＞F0.01(9,10)=4.95，達到極顯著水平；復相關系數R2=0.993 3，校正復相關系數Radj2=0.987 3，均說明該方程與實際情況擬合良好，正確反映了綜合評分與乙醇濃度、提取時間和提取劑用量與五加葉質量之比的關系。

各實驗因子的偏回歸系數的檢驗結果表明：X1，X2，X3，X1X2，X12，X22，X32的偏回歸系數均達到極顯著水平，這些因素對綜合評分的影響極顯著，而且不是簡單的線性關系；交互項X2X3未達到顯著水平，但由于各系數間具有相關性，微弱的交互項原則上不能刪除，因此，方程不能簡化[16]。

2.2 主因子效應分析

由于回歸模型本身已經過無量綱編碼代換，其偏回歸系數已經標準化，故可直接從其絕對值來判斷各因子對目標函數的相對重要性，即一次項系數的絕對值可反映3因素對綜合評分的影響程度，由回歸方程可知3因素的影響程度從大到小依次為：乙醇濃度，提取時間，提取劑用量與五加葉質量之比。

表3 試驗結果方差分析表Table 3 Analysis of mean square deviation for experiment data

2.3 單因子效應及其邊際效應分析

分別將回歸方程中的2個變量固定在零水平，進行降維分析，即可得到3個以其中1個因素為決策變量的偏回歸模型：

根據單因子效應方程作圖，得到單因子效應曲線(圖 4)。經計算，當 X1=-1.682，X2=-0.4476，X3=1.682，即乙醇濃度為53%，提取時間為213 s，提取劑用量與五加葉質量之比為46.8時，各單因素對綜合評分的影響最大，最大值分別為 Y1max=21.465，Y2max=16.476，Y3max=17.058。

圖4 單因子效應曲線Fig.4 Single factor utility curves

對單因子效應方程求一階偏導數，得到單因子邊際效應方程。單因子邊際效應方程反映了綜合評分隨不同因子編碼值的變化速率。單因子效應方程為：

根據單因子邊際效應方程可以得到單因子邊際效應曲線(圖5)。由圖5可知，3條曲線斜率的絕對值依次為：X1＞X2＞X3，說明乙醇濃度的變化對綜合評分的影響最大，提取時間次之，提取劑用量與五加葉質量之比最小，與主因子效應分析結果一致。

圖5 單因子邊際效應曲線Fig.5 Marginal utility curves

2.4 因子的交互效應分析

為了觀察2個因素同時對綜合評分的影響，可以進行降維分析。令其中1個因素的水平為0，就可得到另外2個因素對綜合評分影響的二元二次方程：

根據方程分別繪制響應面三維圖和等高線圖，結果如圖6～11所示。

圖6 乙醇濃度和提取時間響應面圖Fig.6 Response of surface of alcohol level and extraction time

圖7 乙醇濃度和提取時間等高線圖Fig.7 Contour line of alcohol level and extraction time

圖8 乙醇濃度和提取劑用量與五加葉質量之比響應面圖Fig.8 Response of surface of alcohol level and extracting agent concentration

圖9 乙醇濃度和提取劑用量與五加葉質量之比等高線圖Fig.9 Contour line of alcohol level and extracting agent concentration

圖6 和圖7反映了乙醇濃度X1和提取時間X2之間的交互作用。當 X2處于編碼值范圍內時，Y隨 X1的減小而顯著增大；當X1處于低編碼值范圍內時，Y隨X2的減小也呈增大趨勢；因此，乙醇濃度和提取時間兩者具有顯著協同作用。

圖10 提取時間和提取劑用量與五加葉質量之比響應面圖Fig.10 Response of surface of extraction time and extracting agent concentration

圖11 提取時間和提取劑用量與五加葉質量之比等高線圖Fig.11 Contour line of extraction time and extracting agent concentration

圖8 和圖9反映了乙醇濃度X1和提取劑用量與五加葉質量之比 X3的交互作用。當X3處于編碼值范圍內時，Y隨X1的減小而顯著增大；當X1處于較低編碼值范圍內時，Y隨X3的減小只有微弱變化；因此，乙醇濃度和提取劑用量與五加葉質量之比兩者之間的協同作用不明顯。

圖10和圖11反映了提取時間X2和提取劑用量與五加葉質量之比 X3的交互作用。由于交互項 X2X3未達到顯著水平，故不進行具體討論。

2.5 數學模型尋優

利用回歸方程，在試驗約束區域內(-1.682≤X1≤1.682，-1.682≤X2≤1.682，-1.682≤X3≤1.682)，取步長為0.116，通過MATLAB編程，進行計算機模擬仿真選優(實驗次數N=30)，得到27 000套方案的模擬結果，從中篩選出綜合評分≥22.000的組合方案326套，占1.21%，Xi的頻率分布解析見表4。

由表4可以看出，當X1為-1.682，X2=-1.278 3～-0.927 1，X3=-0.558 4～0.408 2時，綜合評分有95%的可能性高于22.000。此時，相應的解碼值為：乙醇濃度為53%，提取時間為163.3～184.4 s，提取劑用量與五加葉質量之比為24.4～34.1。

表4 綜合評分≥22.000的優化提取方案中Xi取值頻率分布Table 4 Probability distribution of Xi in combined application

2.6 最佳工藝參數的確定與回歸模型的驗證

考慮到可操作性及貼近實際工業化生產，將最優提取條件定為：乙醇濃度53%，提取時間175 s，提取劑用量與五加葉質量之比為30 mL/g。

為驗證上述優選出來的工藝，按數據分析得出的最優提取條件進行驗證實驗，結果如表5所示。

表5 最佳工藝驗證實驗結果Table 5 Confirmatory experiment result of the best technique

由表5可知：該工藝的綜合評分為22.292，RSD=0.77%。與表 2實驗結果相比，該工藝的綜合評分高于優化實驗中的任何一組，且該工藝穩定，重現性好，操作簡單、省時。

3 討論

閃式提取法是中藥提取領域的一項新技術，其原理是在適當溶劑存在下，利用高速機械剪切力和攪拌力，迅速破壞植物細胞組織，使組織細胞內部的化學成分(或有效成分)與溶劑充分接觸，使有效成分快速溶解轉移，在很短時間內達到內外溶解平衡，然后過濾即可。其所用時間僅為常規回流提取的數十至數百分之一，而且避免了不耐熱成分的破壞，且收率高，操作簡便，節約溶劑和能源[11-12]。

在溶劑和波長的選擇中，分別考察了甲醇法和NaHCO3飽和溶液法[15]。結果發現：甲醇法波長掃描后得到的是倒峰，沒有出現特定吸收峰，故不能選擇甲醇作為測定細柱五加葉中三萜類物質的溶劑；在NaHCO3飽和溶液中，五加皂苷的最大吸收峰(218 nm)與其苷元的(214 nm)非常接近，不能同時或分別測定它們的含量，只能測定三萜成分的總含量。研究表明，葉中皂苷含量遠大于苷元含量[6]，皂苷在飽和NaHCO3溶液中比苷元易溶，且溶液較穩定，故選擇五加皂苷為測定用的對照品，檢測波長為218 nm。

4 結論

(1) 采用閃式提取法提取細柱五加葉中三萜成分，并用二次通用旋轉實驗設計優化其提取工藝，結果得到最佳工藝如下：乙醇濃度為53%，提取劑用量與五加葉質量之比為30 mL/g，提取時間為175 s。驗證實驗結果表明：該工藝穩定，重現性好，操作簡單、省時。

(2) 確定了 UV法測定細柱五加葉及其提取物中總三萜成分的方法為以五加皂苷為對照品，飽和NaHCO3溶液為溶劑，218 nm為最適波長。該方法穩定可靠，易于操作，可用于細柱五加葉、五加皮以及其同屬植物中總三萜成分含量的測定。

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