中獸藥散劑中非法添加利巴韋林的檢測方法研究

崔成富，陳創華，林海丹，黃寶珠，鄧國東

(廣東省獸藥與飼料監察總所，廣州 510230)

利巴韋林(Ribavirin)，又稱病毒唑或三氮唑核苷，為廣譜抗病毒藥物，對多種病毒有抑制作用。該藥曾在畜牧業和水產養殖業廣泛應用，用于預防和治療病毒性疾病。但其作為人用抗病毒藥移植獸用，缺乏科學規范、安全有效實驗數據;用于動物病毒性疫病不但給動物疫病控制帶來不良后果，而且影響國家動物疫病防控政策的實施［1］;不規范使用可導致動物中毒［2］，在動物性食品中的殘留對人體具有潛在危害，可引起變態反應和造血系統功能障礙［3］，因此農業部公告第560號已規定取消其在動物疾病預防控制上的使用。但目前仍有部分獸藥生產企業為了提高某些中獸藥散劑的所謂抗病毒療效，在中獸藥散劑中非法添加了利巴韋林，致使飼養戶在不知情的情況下使用了這些產品，從而容易導致藥物在動物源性食品中殘留，嚴重影響動物產品的質量安全，進而危害人體健康。目前我國尚無中獸藥散劑中利巴韋林的檢測方法，對此類違法行為缺乏有效的監測手段。本研究在對中獸藥散劑中利巴韋林顯微特征進行觀察的基礎上，建立一種簡便、靈敏、準確的高效液相色譜法，對中獸藥散劑中非法添加的利巴韋林進行定性定量測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 卡爾·蔡司顯微鏡:Standard25ICS;高效液相色譜儀:Aglient 1200型，配二極管陣列檢測器，美國 Aglient公司;電子天平:CPA225D型，德國 Sartorius公司;制超純水機:F3PN33491型，美國Millipore公司。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對照品 利巴韋林對照品，批號629－200202，含量100.0%，由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2.2 供試品

1.2.2.1 陰性對照散劑 清瘟敗毒散:廣州綠州生物技術有限公司;蒼術香連散:廣州市和生堂動物藥業有限公司。以上兩種中獸藥散劑經檢測均不含利巴韋林。

1.2.2.2 陽性添加散劑 分別按照0.05%、0.1%和0.2%的比例在陰性對照散劑中添加利巴韋林對照品，混勻。

1.2.2.3 試劑 甘油，超純水。

1.2.2.4 標準儲備液配制(2.5 mg/mL)精密稱取利巴韋林對照品125 mg于50 mL量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為2.5 mg/mL標準儲備液。

1.3 測定方法

1.3.1 顯微檢查法 取利巴韋林對照品、兩種中獸藥散劑的陰性樣品以及陽性添加樣品少許，置載玻片上，滴加甘油2～3滴，攪勻，封片，置顯微鏡下觀察。利巴韋林的顯微特征為無色或淡黃綠色結晶，呈棒形或一端或兩端呈梭形，長短不一，表面有縱裂紋或裂縫紋。

1.3.2 高效液相色譜法

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱為 Ultimate XB－C18(150 mm ×4.6 mm，5μm)，流動相為超純水，檢測波長207 nm，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25℃。

1.3.2.2 樣品測定 精密稱取中獸藥散劑約2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL超純水搖勻，超聲15 min，靜置，濾過，取續濾液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.3.2.3 標準曲線繪制 精密量取標準儲備液，用超純水分別稀釋為 1、5、25、50、100、150 μg/mL濃度的系列標準溶液，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2 結果

2.1 顯微圖 按1.3.1項方法，對利巴韋林對照品、兩種中獸藥散劑的陰性樣品以及陽性添加樣品進行觀察。顯微圖譜如圖1所示。

圖1 利巴韋林對照品顯微圖譜

2.2 色譜圖 在1.3.2.1項的色譜條件下，對利巴韋林對照品溶液、兩種中獸藥散劑的陰性樣品溶液以及陽性添加樣品溶液采用峰面積法進行測定。利巴韋林與樣品中其他成分能夠很好地分離，利巴韋林的保留時間約為5.9 min，其峰形良好。利巴韋林對照品溶液光譜及色譜圖、兩種中獸藥散劑的陰性樣品溶液及陽性樣品溶液色譜圖如圖2～圖4所示。

圖2 利巴韋林對照品溶液(50 μg/mL)光譜圖和色譜圖

2.3 標準曲線 以利巴韋林色譜峰面積Y與對照品溶液濃度C(μg/mL)作線性回歸，得到線性方程為 Y=26.058C+0.5228(r=1.00000)，結果表明利巴韋林在1～150 μg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗 取每1 mL含50 μg的利巴韋林對照品溶液重復進樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，計算變異系數RSD，結果如表1所示。結果表明6次重復進樣的RSD為0.02%，外標法測定利巴韋林具有良好的重現性。

表1 連續進樣精密度試驗結果(n=6)

2.5 最低檢測限 在上述色譜條件下，將利巴韋林對照品溶液加入陰性散劑中，并逐步減少對照品溶液的量，按1.3.2.2制備進樣，以信噪比的3倍為最低檢出限，測得蒼術香連散的最低檢出濃度為0.1 μg/mL，最低檢測限為 2 mg/kg;清瘟敗毒散的最低檢出濃度為0.05 μg/mL，最低檢測限為 1 mg/kg。

2.6 重復性試驗 精密稱取已添加利巴韋林的蒼術香連散與清瘟敗毒散(0.1%添加量)各6份，按1.3.2.2項方法測定，計算利巴韋林的含量，考察方法重復性。結果表明方法重復性良好，其RSD分別為 1.04%和 1.32%。

2.7 穩定性試驗 取上述2.6項下制備的供試液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h 進樣測定，記錄色譜峰面積。結果表明樣品溶液在24 h穩定性良好。

2.8 回收率 取上述兩種中獸藥的散劑按表2添加不同濃度的利巴韋林制成陽性散劑，按照1.3.2.2項方法測定，計算回收率及其變異系數。每個散劑的每個添加濃度進行6次重復測定。結果如表2所示。結果顯示，兩種中獸藥散劑的添加平均回收率在91.74% ～98.50%之間，變異系數在0.08% ～0.58%之間?？紤]到中藥散劑成分的復雜性，測試數據表明該方法回收率較好，準確度高。

表2 中獸藥散劑中利巴韋林添加回收率及其變異系數

3 討論

3.1 中獸藥散劑種類的選擇 清瘟敗毒散具有瀉火解毒、涼血功效，主治熱毒發斑、高熱神昏。蒼術香連散具有清熱燥濕的功效，主治腸黃、下痢、濕熱泄瀉。這兩種散劑均有一定的預防和治療腸道感染的作用。利巴韋林因對DNA和RNA病毒均有效，對腸病毒等引起的感染有顯著療效，故在畜禽養殖中極有可能被非法添加到上述兩種中獸藥散劑中，用于治療和預防腸道感染。因此本研究選取了清瘟敗毒散和蒼術香連散作為檢測的對象。

3.2 快速篩選方法的建立 因液相法相對檢測周期長，成本高，本方法首先使用顯微檢查方法對樣本進行快速篩選。顯微檢查中若檢出如圖1中所示結晶物質，則表明可能非法添加利巴韋林;對陽性樣品再利用高效液相色譜法，通過與對照品色譜圖保留時間、光譜圖的比對，可實現對兩種中獸藥散劑中的利巴韋林進行大批量的快速定性判定和定量測定。

3.3 顯微試液的選擇 對利巴韋林特征進行顯微觀察時，分別用水合氯醛、甘油醋酸、甘油乙醇和甘油試液進行了試驗。結果表明用水合氯醛、甘油醋酸和甘油乙醇試液時，因利巴韋林溶于水、微溶于乙醇，在顯微鏡下觀察不到利巴韋林的顯微特征;而用甘油試液則可以很好地觀察到其顯微特征，選擇甘油試液可以在顯微鏡下觀察到中獸藥散劑中添加0.05%的利巴韋林的顯微特征。所以最終以甘油作為利巴韋林顯微觀察的試劑。

3.4 提取溶劑、流動相的選擇 考慮到中獸藥散劑中多種成分溶于有機溶劑，可能干擾利巴韋林的檢測，而利巴韋林溶于水，故排除用有機溶劑作提取液，而采用超純水作為提取溶劑［3］。通過調節超純水的pH值(pH 6～8)實驗，發現pH值對利巴韋林的出峰時間和峰形無明顯影響，故用普通超純水作流動相。

3.5 色譜柱的選擇 在用超純水作流動相［3］時，曾用Zorbax Eclipse XDB－C18(Aglient)為色譜柱，發現出峰時間比較短，與雜峰分離度不佳，且出峰保留時間不一致，重復性不好。改用親水性色譜柱Ultimate XB－C18(Welch Materials)后，與雜峰分離較好，特別是保留時間重復性改善，故使用親水性色譜柱Ultimate XB－C18(Welch Materials)來測定利巴韋林。

3.6 添加回收率試驗濃度的選擇 根據兩種中藥散劑在預防和治療畜禽的用量及臨床中利巴韋林的預防和治療用量，選擇在中獸藥散劑中分別添加0.05%、0.1%和 0.2%利巴韋林作為陽性對照，測定其回收率及變異系數，可以更符合非法添加利巴韋林的實際情況。

4 結論

本文建立的顯微檢查初篩、再用高效液相色譜進行定性及定量的分析方法可快速、準確地鑒定和測定清瘟敗毒散和蒼術香連散兩種中獸藥散劑中違法添加的利巴韋林，對更好地控制產品質量具有一定的實用價值。

［1］楊春蓮.一起豬利巴韋林中毒的診治［J］.黑龍江畜牧獸醫，2010，5:94.

［2］張 俊，閆 煒，何振鳳，等.利巴韋林不良反應綜述［J］.臨床藥物治療雜志，2004，1:61 －62.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二○○○年版(二部)［M］.北京:化學工業出版社，2000:302.