響應面法優化不同蛋白酶制備麥麩膳食纖維

黃紀念，王長虹，2，孫 強，宋國輝，蘆 鑫，張麗霞

(1.河南省農業科學院 農副產品加工研究所，河南 鄭州 450002;2.河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州 450002)

膳食纖維是一種被稱為“第七營養素”［1］，不能被人體消化吸收的多糖，但對人體具有十分重要的生理功能。研究表明，膳食纖維通過調節體內碳水化合物和脂質的代謝，影響礦物質的吸收，促進腸道蠕動，增進腸道內有益菌群增殖等生理作用［2］。因此，它對腸癌、便秘、肥胖病、糖尿病、心血管疾病等慢性疾病有一定的預防和治療作用［3-5］。

麥麩是面粉加工的主要副產品，含有35%～50%的膳食纖維［6］，其中的纖維素和半纖維素，是優質的膳食纖維來源［7-8］。目前，麥麩膳食纖維制備方法主要有化學法、酶法、酶-化學法［9-12］。化學法制得的膳食纖維純度較高，但色澤深、不易漂白;產品堿味重、口感不佳［6］，且加工條件較為苛刻，儀器設備要求高，并污染環境。酶-化學法制備膳食纖維中也需加入酸、堿、鹽等，會造成鹽殘留，從而影響膳食纖維的適口性與安全性。酶法制備的膳食纖維品質較酶-化學法高，色澤淺，易漂白，無異味，條件溫和，對環境污染小。因此，我們采用酶法從麥麩中提取膳食纖維，通過響應面優化實驗確定最佳提取條件，并比較不同蛋白酶對麥麩膳食纖維純度的影響。現將有關結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥麩皮。鄭州市面粉廠提供，原料麥麩組成成分為水分6.81%，總膳食纖維47.31%，脂肪2.16%，不溶性膳食纖維 45.30%，蛋白質15.78%，水溶性膳食纖維2.01%，淀粉19.14%，灰分4.86%。

中溫 a-淀粉酶(4 000 U·g-1)、風味蛋白酶(20 000 U·g-1)和胰蛋白酶 (250 000 U·g-1)由GIBCO公司提供;糖化酶(100 000 U·g-1)和堿性蛋白酶 (200 000 U·g-1)Solarbio公司提供。

主要儀器與設備。UV-2800紫外分光光度計，上海尤尼柯公司;XMTA-608電熱鼓風干燥箱，上海佳盛有限公司;Anke DL-5-B低速大容量離，上海安亭公司;HH-S恒溫水浴鍋，上海博迅公司;KS-600EI超聲波清洗機，寧波海曙科生公司;ZDDN-Ⅱ全自動凱氏定氮儀，杭州托普有限公司;XS205分析天平，上海梅特勒-托利多公司;KLUP-IV-10艾柯超純水機，臺灣艾柯公司等。

1.2 麥麩膳食纖維制備工藝流程

1.2.1 原料預處理

過篩水洗麥麩:按原料麥麩與水1∶10(m∶m)配置浸泡30 min，然后過孔徑0.125 mm(120目)的篩，水洗至澄清，以除去麩皮表面部分淀粉及其他雜質［13］。

分解植酸:取上述麥麩與水以1∶10(m∶V)的比例混合，用濃H2SO4調pH值至5.0～5.5，保持50～60℃，充分攪拌 10 h，用清水漂洗至中性［14］。

脫除脂肪:將上述濕麥麩加4倍于體積的無水乙醇并浸泡3 h，水洗至中性［15］，然后置于鼓風干燥箱，60℃烘干。

酶水解淀粉:取上述麥麩10.000 g(干基)，加入100 mL的水，55℃下，用100 g·L-1的檸檬酸調節pH值至6.0，同時加入4%(m∶m)的淀粉酶 (中溫 α-淀粉酶∶糖化酶為1∶3，m∶m)，恒溫攪拌2.5 h，沸水浴15 min滅酶。

1.2.2 酶解麥麩蛋白

將上述反應體系保持至設定溫度，用2.0 mol·L-1的氫氧化鈉調節pH值到設定值，再加入一定量的蛋白酶，酶解麥麩蛋白。酶解結束后，沸水浴15 min滅酶。然后冷卻、水洗酶解剩余物至中性，60℃干燥24 h，得到麥麩膳食纖維。

1.3 麥麩基本成分測定

水分含量測定，直接干燥法 (GB/T5009.3.2003);蛋白質含量測定，凱氏定氮法(GB/T5009.5.2003);脂肪含量測定，索氏抽提法(GB/T5009.6.2003);灰分含量測定，直接灰化法(GB/T5009.4.2003);淀粉含量測定，酶水解法(GB/T5009.9.2003);膳食纖維含量測定，酶重量法(GB/T22224.2008)。

1.4 水解度測定

蛋白質水解度 (DH):采用pH-State法。

DH(%)=游離氨基態氮 (g)/總氮 (g)×100。

1.5 膳食纖維純度測定

膳食纖維純度測定 (%)=酶解后麥麩中總膳食纖維質量 (g)/酶解后的麥麩質量 (g)×100。

1.6 響應曲面 (RSM)實驗設計

采用Box-Behnken設計，對工藝條件進一步研究，以獲得最佳工藝參數。

1.7 實驗數據統計與分析

采用Design Expert 7.1.2處理數據，P＜0.05為顯著，P＜0.01極顯著。無特殊說明，所有實驗平行測定3次，結果均為平均值。

2 結果與討論

2.1 不同因素對蛋白酶酶解效果的影響

從酶解蛋白過程考慮，分別了解酶解時間、pH值、酶解溫度以及酶用量對麥麩蛋白水解度的影響，確定響應面實驗因素水平，從而探討最佳工藝條件。

2.1.1 時間

取麥麩10.000 g(干基)將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶反應體系的pH值分別控制為8.5，7.5和 7.0，加酶量分別為 600 U·mg-1蛋白，750 U·mg-1蛋白，60 U·mg-1蛋白，酶解溫度分別為60℃，55℃和55℃的條件下，研究時間對3種蛋白酶酶解麥麩蛋白水解的影響，結果如圖1所示。

圖1 時間對蛋白酶酶解效果的影響

從圖1可以看出，酶解時間從0.5 h到2.0 h時，胰蛋白酶、風味蛋白酶水解度快速增加，2.0 h之后水解度增加緩慢，而堿性蛋白酶酶解時間從0.5 h到3.0 h時，水解度增加比較明顯，3.0 h以后增加緩慢。這可能與酶解反應進行到一定時間后，蛋白酶酶解作用位點數目所剩很少，再延長酶解時間，水解度增加并不明顯有關。因此分別選擇3.0，2.0，2.0 h作為其他單因素實驗的因素水平。2.1.2 溫度

取麥麩10.000 g(干基)將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶反應體系pH值分別控制為8.5，7.5和 7.0，加酶量分別為 600 U·mg-1蛋白，750 U·mg-1蛋白，60 U·mg-1蛋白，酶解時間分別為3.0，2.0，2.0 h條件下，研究溫度對3種蛋白酶酶解麥麩蛋白水解度的影響，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，溫度從45℃變化到55℃時，胰蛋白酶、風味蛋白酶對麥麩蛋白的水解度隨著溫度的升高而增大，當溫度為55℃時，水解度達到最大，超過55℃麥麩蛋白水解度呈下降趨勢;對于堿性蛋白酶，溫度從45℃變化到60℃時麥麩蛋白水解度隨著溫度的升高而增大，當溫度為60℃時，水解度達到最大，超過60℃麥麩蛋白水解度呈下降趨勢;因此分別選擇60℃，55℃，55℃作為堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶其他單因素的實驗因素水平。

圖2 溫度對蛋白酶酶解效果的影響

2.1.3 pH值

取麥麩10.000 g(干基)將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶的酶解溫度分別控制為60℃，55℃，55℃，加酶量分別為 600 U·mg-1蛋白，750 U·mg-1蛋白，60 U·mg-1蛋白，酶解時間分別為3.0，2.0，2.0 h條件下研究 pH值對3種蛋白酶酶解麥麩蛋白水解度的影響，結果如圖3所示。

圖3 pH值對蛋白酶酶解效果的影響

從圖3可以看出，對堿性蛋白酶，pH值從8.0變化到9.0時，麥麩蛋白水解度隨著pH值的增大而增大，當 pH值為9.0時，水解度達到最大，超過9.0之后麥麩蛋白水解度呈下降趨勢;pH對胰蛋白酶、風味蛋白酶水解度的影響整體趨勢和堿性蛋白酶相似，但胰蛋白酶、風味蛋白酶對麥麩的最佳酶解 pH分別為7.5，7.0。因此取 p H為9.0，7.5，7.0分別作為其他單因素實驗的因素水平。

2.1.4 加酶量

取麥麩10.000 g(干基)將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶的酶解溫度分別控制為60℃，55℃，55℃，酶解時間分別為3.0，2.0，2.0 h，酶解p H值分別為9.0，7.5，7.0條件下研究加酶量對3種蛋白酶蛋白酶酶解麥麩蛋白水解度的影響，結果如圖4所示。

圖4 加酶量對蛋白酶酶解效果的影響

從圖4可看出，堿性蛋白酶加酶量從200～1 000 U·mg-1蛋白時，麥麩蛋白的水解度快速增加，超過1 000 U·mg-1蛋白時麥麩蛋白水解度增加非常緩慢。胰蛋白酶、風味蛋白酶加酶量對麥麩蛋白水解度的影響整體趨勢與堿性蛋白酶相似，加酶量分別從 200～800 U·mg-1蛋白和 20～100 U·mg-1蛋白時，麥麩蛋白的水解度快速增加，超過800 U·mg-1蛋白和100 U·mg-1蛋白時麥麩蛋白水解度增加非常緩慢。這說明在底物濃度一定時，麥麩蛋白的水解效率取決于酶用量，酶用量越大，酶的催化位點與蛋白質分子相應位點接觸幾率越多，水解速度越快。

2.2 堿性蛋白酶酶解麥麩蛋白的條件優化

從單因素實驗可以看出，堿性蛋白酶水解麥麩蛋白過程中，加酶量、酶解時間、酶解溫度和p H都對水解度有較大的影響。因此在上述單因素實驗基礎上利用Design Expert軟件，采用中心組合實驗Box-Behnken設計方案［16-17］進行響應曲面實驗設計［18］，考察4個因素之間的相互作用對酶解反應的影響 (表1)，確定堿性蛋白酶水解麥麩蛋白的最優工藝條件。

Box-Behnken中心組合中，加酶量因素 (X1)水平為800，1 000，1 200 U·mg-1，其編碼值分別為-1，0，1;溫度因素 (X2)水平為55℃，60℃，65℃，其編碼值分別為-1，0，1;p H值因素 (X3)水平為8.5，9.0，9.5，其編碼值分別為-1，0，1;時間因素 (X4)水平為2.0，2.5，3.0 h，其編碼值分別為 -1，0，1。

表1 響應面分析實驗的結果

利用Design Expert軟件，對表1中的實驗結果進行多元回歸擬合，獲得麥麩蛋白水解度對加酶量、溫度、p H值、時間的二次多項回歸方程:

從回歸方程的方差分析結果 (表2)可見，本實驗所選用的二次多項模型F值為14.30**，為極顯著;失擬項在P=0.05水平上不顯著，整個模型的R2為0.935，變異系數為3.153%。表明方程的因變量與全體自變量之間的回歸效果顯著，此回歸方程能解釋實際情況。

由回歸方程的各項系數顯著性檢驗可知，水解度方程的一次項顯著，各因素的交叉項相互作用不顯著，二次項極顯著，說明各個具體實驗因素對響應值的影響不是簡單的一次線性關系，而是二次拋物面的關系。由于各個因素之間的交互作用在實驗中基本上沒有什么影響。所以在以后的實驗中可以不考慮各個因素之間的交互作用。

表2 回歸方程各項的方差分析結果

由Design-Expert統計分析軟件作響應曲面及等高線圖，分析加酶量、溫度、酶解時間對堿性蛋白酶水解度的影響 (圖5)。各因素及其交互作用對響應值的影響趨勢可通過這組圖直接反應出來。

從圖5中可以看出，各因素之間對模糊綜合評價值評價的影響有協同作用。加酶量X1對響應值的影響最大，是水解度的最主要因素，表現為曲線較徒;酶解時間X4次之。因此選擇合適的加酶量和酶解時間，可獲得麥麩的較高水解度。在3個對水解度影響較大的因素中，從大到小依次為加酶量＞酶解時間＞酶解溫度，即加酶量對水解度的影響最為顯著，酶解溫度相對影響不大。

圖5 加酶量、酶解溫度和酶解時間的響應面

2.3 最佳實驗條件確定

在所選各因素范圍內，通過Design-expert7.0軟件建立模型分析，得出利用堿性蛋白酶提取麥麩膳食纖維的最佳工藝條件為加酶量1 136 U·mg-1蛋白，酶解溫度59.94℃，pH值8.91，酶解時間2.19 h，該條件下水解度預測值為24.02%。采用上述優化條件做驗證實驗，同時考慮到實際操作的情況，將優化溫度修正為60℃，結果麥麩膳食纖維水解度為 24.13%，麥麩膳食纖維純度為93.28%。

2.4 風味蛋白和胰蛋白酶酶解麥麩蛋白的條件優化

采用與前面堿性蛋白酶一樣的研究方法，分別改用風味蛋白酶和胰蛋白酶，研究加酶量、溫度、pH、時間對麥麩蛋白水解度的影響，并用響應面法優化這2種酶的最佳條件，比較堿性蛋白酶，胰蛋白酶，風味蛋白酶對麥麩蛋白水解度及膳食纖維純度的影響。胰蛋白酶，風味蛋白酶的實驗因素水平及其編碼值如表3所示。

由表4可知，以水解度為指標，堿性蛋白酶，胰蛋白酶，風味蛋白酶在響應面優化的條件下，對麥麩蛋白水解能力大小順序為堿性蛋白酶＞風味蛋白酶＞胰蛋白酶;膳食纖維純度為堿性蛋白酶處理樣品＞風味蛋白酶＞胰蛋白酶。

由表5實驗結果可以看出，堿性蛋白酶，胰蛋白酶，風味蛋白酶都在相同酶活400 U·mg-1下，對麥麩蛋白的水解能力大小順序為堿性蛋白酶＞風味蛋白酶＞胰蛋白酶。這可能由于堿性蛋白酶可以裂解Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和 Gln的羧基端及Ala、val、Try［19］，較胰蛋白酶和風味蛋白酶水解麥麩蛋白能力更強。從純度的角度來分析，3種酶中堿性蛋白酶為水解麥麩蛋白質的最佳蛋白酶。這與國外采用的商業堿性蛋白酶作為水解蛋白酶的研究結果相一致［20］。

表3 胰蛋白酶和風味蛋白酶實驗因素水平及其編碼值

表4 3種酶的酶解優化條件及膳食纖維純度

表5 相同酶活下3種蛋白酶對麥麩蛋白水解度影響

3 小結

利用響應曲面法優化了堿性蛋白酶，胰蛋白酶，風味蛋白酶對麥麩蛋白的酶解工藝，堿性蛋白酶最佳酶解條件為加酶量1 136 U·mg-1，pH值8.91，酶解溫度59.94℃，酶解時間2.19 h，水解度達到24.13%，膳食纖維的純度為93.28%;胰蛋白酶最佳酶解條件為加酶量為1 345 U·mg-1，pH值為7.25，溫度為55.00℃，時間為 2.30 h，水解度達到11.22%，膳食纖維的純度為86.55%;風味蛋白酶最佳酶解條件為加酶量為126 U·mg-1，pH為7.00，溫度56.80℃，時間2.80 h，水解度達到 4.87%，膳食纖維的純度為63.38%。

以水解度為指標，在最優條件下，堿性蛋白酶的水解能力遠大于胰蛋白酶和風味蛋白酶，其中以這3種酶得到的麥麩膳食纖維的純度，堿性蛋白酶也明顯優于風味蛋白酶和胰蛋白酶。因此堿性蛋白酶為酶解麥麩蛋白的最佳蛋白酶。

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