風味蛋白酶水解畜產膠原蛋白的工藝

陳新峰，張治國，王君虹，周利亙

(浙江省農業科學院 食品科學研究所，浙江 杭州 310021)

膠原蛋白是人體內含量最多、分布最廣泛的蛋白質，是一種與組織和器官功能密切相關的功能性蛋白。膠原蛋白的低免疫原性、生物相容性、生物降解性［1-3］和生物活性等特性，被愈來愈多的消費者所認識。膠原蛋白制品已被廣泛應用于食品、保健食品、化妝品、醫藥等領域，市場需求急劇增加［4］。天然膠原蛋白經蛋白酶水解后，可得到具有抗氧化、降血壓、降血脂、免疫調節、激素調節、抗疲勞等生理調節功能的小肽，是極具發展前景的功能因子，也是當前醫藥、食品界最熱門的研究課題之一［5-6］。試驗研究以畜產加工下腳料皮、骨等為原料，應用風味蛋白酶水解技術提取畜產膠原蛋白，采用正交試驗優化酶解工藝參數。現將試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑和儀器

畜產膠原蛋白，實驗室自制;95萬U·g-1風味蛋白酶，上海海洋生物技術有限公司產品;21萬U·g-1堿性蛋白酶、120萬U·g-1木瓜蛋白酶、3.7萬U·g-1菠蘿蛋白酶、247萬U·g-1中性蛋白酶、脂肪酶，南寧龐博生物工程有限公司產品;甲醛、氫氧化鈉、濃硫酸，均為分析純。

儀器設備有ALB-224電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品;DK-8 D恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設備有限公司產品;PB-10型p H計，賽多利斯科學儀器有限公司產品。

1.2 制備和檢測

1.2.1 畜產膠原蛋白溶液的制備

取畜產加工下腳料豬皮除去表面脂肪，破碎后加1倍水，攪拌均勻，30℃恒溫水浴，加入NaOH調節pH值為9.0，加入0.1%的脂肪酶酶解30 min，85℃滅酶5 min，冷卻后漂洗，然后進行組織搗碎，配成50%的畜產膠原蛋白液，待用。

1.2.2 畜產膠原蛋白的酶水解

將預處理的畜產膠原蛋白，配成蛋白含量為4%的溶液，升溫至90℃，保持15 min預處理，調節到一定溫度，并調節pH值，添加蛋白酶，恒溫酶解，酶解過程中維持pH值穩定。酶解完畢后，100℃滅酶10 min，過濾，取上清液。

1.2.3 檢測方法

所有樣品均取樣測定3次，取平均值。總氮含量按GB 5511—1985的方法測定，水解度采用游離氨基酸態氮甲醛快速滴定法［7］測定。

1.3 試驗設計

1.3.1 蛋白酶的篩選

選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶作供選酶，按照蛋白酶各自的適宜溫度和p H值條件，酶解畜產膠原蛋白，測定不同蛋白酶酶解畜產膠原蛋白的水解度。通過比較各自的水解度，選擇合適的蛋白酶。

1.3.2 風味蛋白酶單因素試驗

［E/S］試驗。在pH 7.0、50℃下，選取不同［E/S］條件，酶解5.0 h、分別測定水解度。

p H試驗。在 ［E/S］1/10、溫度 50℃條件下，選取不同的p H條件，酶解5.0 h，測定各自的水解度。

酶解時間試驗。在 ［E/S］1/10、pH值什7.0、溫度50℃條件下，選取不同的酶水解時間，測定各自的水解度。

酶解溫度試驗。在 ［E/S］1/10、pH值7.0條件下、選取不同的酶解溫度，酶解5.0 h，測定各自的水解度。

1.3.3 風味蛋白酶正交試驗

進行4因素正交試驗，設 A因素為 ［E/S］值，B因素為pH值，C因素為酶解時間和D因素為酶解溫度，采用L9(34)正交表進行工藝參數優化研究。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶的效果

由圖1看出，不同蛋白酶對畜產膠原蛋白的酶解效果各不相同，其中風味蛋白酶酶解水解度為14%，明顯優于其它4種蛋白酶。因此，對風味蛋白酶進行進一步試驗。

圖1 不同蛋白酶水解度比較

2.2 單因素的效果

2.2.1 ［E/S］值

由圖2看出，風味蛋白酶水解度隨著 ［E/S］的升高而增大，當 ［E/S］值上升到1/10后，達到最高點，超過1/10后，水解度增加甚微，因此，選用 ［E/S］為1/10較為適宜。

圖2 酶比底物 ［E/S］對水解度的影響

2.2.2 pH值

由圖3看出，風味蛋白酶酶解畜產膠原蛋白的水解度從pH值為5時開始，隨著pH值的上升而相應提高，當pH值為 7.0時達到最高點，pH值超過7.0后開始下降，表明中性條件對風味蛋白酶的酶解效果優于酸性和堿性條件，選用pH值 7.0較為適宜。

圖3 pH對水解度的影響

2.2.3 時間

由圖4看出，風味蛋白酶水解度隨著酶解時間的延長而相應增加，當酶解時間達到5.0 h時，水解度達到最高，超過5.0 h后幾乎保持不變，因此，酶解時間選用5.0 h較為適宜。

圖4 酶解時間對水解度的影響

2.2.4 溫度

由圖5看出，風味蛋白酶酶解畜產膠原蛋白的水解度隨著溫度的上升而相應提高，50℃達最高點，超過50℃開始下降，酶解溫度50℃較為適宜。

圖5 酶解溫度對水解度的影響

2.3 優化因素的效果

由表1看出，各試驗因素對風味蛋白酶水解效果的影響［E/S］ ＞pH＞酶解溫度＞酶解時間，其優化工藝參數為A3B2C2D2，即 ［E/S］3/25，酶解溫度50℃，pH值 7.0，酶解時間5.0 h。將優化組合進行驗證試驗，其水解效果優于正交試驗表中任1組合，水解度達到19.53%。

表1 風味蛋白酶酶解工藝的優化結果

3 小結

采用風味蛋白酶水解畜產膠原蛋白，其水解度明顯優于其它4種試驗用蛋白酶，且酶解液苦澀味低于其他4種蛋白酶水解液。試驗研究表明，風味蛋白酶酶解畜產膠原蛋白的優化工藝參數為:［E/S］值3/25，酶解溫度50℃，pH值7.0，酶解時間5.0 h;水解度可達到19.53%。

［1］ 石崗.生物活性肽進展 ［J］.北京農業科學，2002(3):9-13.

［2］ 陳國梁，賀翠蓮.膠原蛋白的研究進展 ［J］.延安大學學報:自然科學版，2000，19(2):78-81.

［3］ 焦駝文，孔繁東，等.酶解蛋白制備抗氧化多肽的研究現狀與展望 ［J］.中國釀造，2007(3):5-7.

［4］ 馮成利，黨蕊葉，李校坤，等.豬皮膠原蛋白肽的提取及理化分析 ［J］.陜西師范大學學報:自然科學版，2007，35:20-23.

［5］ 曹榮安，李 浩，李良玉，等.膠原蛋白的生理功能特性及其應用 ［J］.肉制品加工與設備，2010(1):7-9.

［6］ 傅燕鳳，沈月新.淺談魚皮膠原蛋白的利用 ［J］.食品研究與開發，2004，25(2):16-18.

［7］ 何照范，張迪清.保健食品化學及其檢測技術 ［M］.北京:中國輕工業出版社，1997.