桑葉提取物在大鼠體內的代謝產物含量測定及其藥動學研究

蔣立娣，宣貴達，趙 嵐，朱炎斐，樓雪芳

(浙江大學城市學院醫學與生命科學學院，浙江 杭州 310015)

桑葉作為傳統的中藥材之一，具有藥性平和、無毒副作用等特點，已經被國家衛生部正式歸入“藥食同源”之列，引起眾多研究者的關注。黃酮類化合物是桑葉中主要的藥理活性成分之一，它們含有多個羥基，主要以與葡萄糖、鼠李糖等結合成為糖苷的形式存在。研究表明，絕大多數黃酮苷類化合物口服后，首先在腸道微生物或/及小腸上皮細胞水解酶作用下，轉變成相應的黃酮苷元而被吸收，因此，口服黃酮苷類化合物的效應成分多為其苷元［1-3］。綜觀文獻，許多對桑葉黃酮類化合物的研究往往集中在含量測定和藥理學研究方面，如抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等［4-6］，而對其在生物體內的含量測定和吸收情況的研究未見文獻報道，相關的研究是銀杏類藥物中黃酮的體內含量測定和生物利用度比較［7-8］。因此，為了探究桑葉提取物效應成分在體內的吸收和代謝情況，為桑葉類藥物的臨床藥代動力學研究提供一定的參考，建立大鼠血漿中槲皮素、山萘酚和異鼠李素的測定方法很有積極意義。在本研究中，我們建立了同時測定大鼠血漿中槲皮素、山萘酚和異鼠李素的高效液相色譜法，并以建立的方法考察了大鼠口服桑葉提取物后各主要代謝產物濃度隨時間的變化，以DAS藥動學軟件計算了統計矩參數。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥 Agilent1100高效液相色譜儀，DAD檢測器，四元泵，Agilent1100 Chemstation(Agilent公司)。

槲皮素和山萘酚對照品(中國藥品生物制品檢定所)，異鼠李素和木犀草素對照品(南京澤朗醫藥科技有限公司，HPLC級，含量≥98%);桑葉提取物(浙江大學藥學院藥物研究所提供);甲醇為國產色譜純，其他試劑為國產分析純。

1.2 實驗動物 SD大鼠，5只，雄性，180～230 g，清潔級，浙江省實驗動物中心提供。

1.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇∶0.2% 磷酸 =50∶50(v/v)，流速:1.0 ml/min;檢測波長:380 nm;柱溫:37℃;進樣量:75 μl;內標法定量。

1.4 大鼠血樣的采集 大鼠于實驗前15 h禁食(自由飲水)，后尾靜脈采血0.25 ml作為空白血漿，接著灌胃給藥 FME(110 mg/kg)的0.5%CMC-Na混懸液。在分別給藥后的0.0833、0.333、0.667、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120 h，從尾靜脈取血約0.25 ml，置于肝素化的離心管中，10000 r/min離心5 min，分離血漿，－20℃冰箱中保存，備用。

1.5 血漿樣品預處理 精密移取血漿0.1 ml置10 ml離心管中，精密加入9.996 μg/ml的內標物質木犀草素9.0 μl，漩渦混勻1 min，然后漩渦并緩慢加入濃度為3 mol/L HCl 0.2 ml，90℃水浴中水解1 h，冰浴冷卻，冷卻后精密加入乙醚-丙酮(14∶1)混合液3.0 ml，漩渦提取5 min，4000 r/min離心10 min，完全移取上清液揮干，殘渣加入流動相150 μl，漩渦溶解1 min，13000 r/min 離心 10 min，取上清液 75 μl，HPLC進樣分析。

2 結果

2.1 方法選擇性 通過調節流動相比例，當甲醇∶0.2%的磷酸為50∶50(v/v)時槲皮素、木犀草素、山萘酚和異鼠李素均達到基線分離。空白血漿、空白血漿+對照品以及給藥后血漿樣品的HPLC圖譜見圖1。由圖可知，空白血漿在槲皮素、木犀草素、山萘酚和異鼠李素保留時間處均無干擾峰，說明血漿內源性物質不影響本實驗的測定，即本方法具有較好的選擇性。

圖1 大鼠血漿HPLC圖譜Fig.1 Representative HPLC chromatograms of rat plasma

2.2 標準曲線與定量下限 精密移取對照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配成含槲皮素、山萘酚和異鼠李素的濃度分別在0.0545～8.73 μg/ml、0.0954 ～ 14.7 μg/ml、0.0545 ～8.55 μg/ml間的7個不同濃度的標準含藥血漿質控樣品，每一濃度3份，按“1.5”項下操作。以藥物與木犀草素峰面積的比值為縱坐標(Y)，藥物濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，獲得槲皮素、山萘酚和異鼠李素的回歸方程分別為:y1=0.3724x1+0.157(r=0.9979);y2=0.568x2－0.0444(r=0.9993);y3=0.4042x3－0.0179(r=0.9981)。表明槲皮素在0.0545～8.73 μg/ml，山萘酚在 0.0954 ～14.7 μg/ml，異鼠李素在0.0545～8.55 μg/ml范圍內線性良好。槲皮素、山萘酚和異鼠李素的定量下限(LOQ)分別為 0.0545、0.0954和 0.0545 μg/ml。

2.3 回收率 精密移取對照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配成含槲皮素、山萘酚及異鼠李素的濃度為(0.148，0.260，0.148)、(3.04，5.34，2.85)、(6.53，11.0，6.56)μg/ml的質控樣品，每一質量濃度制備5份樣品，按“1.5”項下操作。以槲皮素、山萘酚、異鼠李素及內標與相同藥物濃度條件下純溶劑樣品對照樣本進樣后得到的峰面積進行比較，計算提取回收率;以槲皮素、山萘酚和異鼠李素與內標峰面積的比值代入隨行標準曲線求得各質量濃度測定值，與加入量比較計算方法回收率，結果見表1。

結果表明，高、中、低3個質量濃度下槲皮素和山萘酚的絕對回收率均高于79.4%，但低濃度下異鼠李素的絕對回收率為62.8%，偏低;三者的方法回收率均在94.7% ～107% 。

2.4 方法精密度 精密移取對照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配成含槲皮素、山萘酚及異鼠李素的濃度為(0.148，0.260，0.148)、(3.04，5.34，2.85)、(6.53，11.0，6.56)μg/ml的質控樣品，每一質量濃度制備5份樣品，按“1.5”項下操作，記錄槲皮素、山萘酚及異鼠李素與木犀草素的峰面積比值，代入標準曲線求得各質控樣品的濃度值。計算日內精密度RSD和5 d內的日間精密度RSD，結果見表2。

表1 槲皮素、山萘酚和異鼠李素的回收率Table 1 Recoveries of extraction and assay for quercetin，kaempferol and isorhamnetin(n=5)

表2 槲皮素、山萘酚和異鼠李素的方法精密度Table 2 Presicion of assay for quercetin，kaempferol and isorhamnetin(n=5)

從表2中可知，槲皮素、山萘酚及異鼠李素的日內和日間精密度RSD分別小于9.5%和9.8%，表明該方法準確、精密，重復性較好。

2.5 樣品穩定性 精密移取對照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配制高、低濃度的質控樣品，其中槲皮素(0.300，6.53)μg/ml、山萘酚(0.525，11.0)μg/ml、異鼠李素(0.300，6.56)μg/ml。每一質量濃度3份樣品，按“1.5”項下操作，分別于室溫 0、4、8 h 及 －20℃ 3、7、15 h以及解凍凍融1、2、3次后測定，記錄槲皮素、山萘酚和異鼠李素與木犀草素的峰面積的比值，代入標準曲線求得各質控樣品的濃度值，并與同濃度0 h質控樣品比較后計算回收率。

結果表明，樣品在－20℃冷凍15 d后三者含量均在90.4% ～103%內，穩定性良好。而在室溫條件下，山萘酚穩定性良好，8 h后，高低濃度下的回收率分別為75.8%和80.8%;異鼠李素的穩定性不及山萘酚，8 h后，高濃度下的回收率僅為60.0%;槲皮素的穩定性明顯欠缺，8 h后，高低濃度下的回收率均低于50%，提示樣品不宜在室溫條件下長時間置放。結果也表明，經過2次凍融解凍過程后，待測成分各濃度均在初始濃度的85.5% ～96.7%內，但經過3次凍融，槲皮素高低濃度下、異鼠李素低濃度下的濃度降低較多，僅為初始濃度的74.6%～77.4%，提示實際測定時樣品最多進行2次凍融。

2.6 大鼠體內的藥動學 大鼠灌胃給藥FME(110 mg/kg)，收集給藥前及給藥后0.0833、0.333、0.667、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120 h 時間點血漿。通過建立的HPLC方法，測定不同時間點血漿中槲皮素、山萘酚及異鼠李素的總濃度，利用DAS軟件，計算統計矩參數，結果見表3和圖2。

表3 大鼠口服桑葉提取物后血漿中槲皮素、山萘酚及異鼠李素的藥動學參數Table 3 Pharmacokinetic parameters of quercetin，kaempferol and isorhamnetin in rat plasma after oral administration of FME(n=5)

由圖2可見，大鼠灌胃給藥(110 mg/kg)FME后槲皮素、山萘酚及異鼠李素迅速達到一個峰濃度，6 h左右，山萘酚和異鼠李素第二次達到峰濃度;同時，由表3可知，三者的T1/2z分別為 92.7，67.9 和54.2 h。這提示三者在大鼠體內分布非常迅速，而滯留非常久長。

3 討論

考慮到槲皮素、其它的黃酮類或異黃酮在血漿和尿液中多以甲基化/葡糖醛酸化/硫酸化的結合物形式存在，大鼠血漿中槲皮素、山萘酚及異鼠李素很可能是以游離和結合兩種形式并存。因此，本研究將給藥后血漿水解再進行測定，使三者的葡萄糖醛酸、硫酸酯以及其他結合物均能水解成游離的單體，進而測定各代謝產物的總濃度。研究用單因素考察的方法考察了鹽酸濃度、水浴溫度和水解時間對水解結果的影響，結果表明，鹽酸濃度為3 mol/L，水浴溫度為90℃，水解時間為60 min時，各代謝產物的提取效率較為理想。

圖2 大鼠口服FME(110 mg/kg)后的平均血漿藥物濃度-時間曲線Fig.2 The plasma concentration-time curve of quercetin，kaempferol and isorham-netin in rats after oral administration of FME(110 mg/kg).Data are expressed as mean±SD(n=5)

在內標的選擇中，我們曾采用芹菜素，但芹菜素出峰時間較晚。后考慮到木犀草素結構與被測物相似，根據文獻［9］，其油水分配系數(1ogP)為 2.30，介于槲皮素(2.10)和山萘酚(2.50)之間，分析其保留時間可能也在兩者之間，且我們在做桑葉提取物水解槲皮素和山萘酚含量測定［10］時，在本研究流動相條件下，并未檢測出木犀草素。實驗證實，木犀草素的保留時間恰好落在槲皮素和山萘酚之間，槲皮素、山萘酚、異鼠李素和木犀草素的絕對回收率相差接近10%，符合內標法測定的要求。

本研究中，藥動學結果提示，槲皮素、山萘酚和異鼠李素在大鼠體內的分布迅速，而滯留久長。研究同時顯示，山萘酚和異鼠李素出現雙峰現象，這和文獻報道一致，可能是存在肝腸循環，引起血漿濃度的再次集結。結果也提示，大鼠口服的劑量可能偏高，致使各代謝產物的終末相半衰期遠大于文獻報道。同時我們也認為，本研究的藥物為桑葉提取物，組成成分之間的相互作用可能會使吸收、分布、代謝等轉運環節發生變化，也有可能其中的其它成分在體內的代謝與效應成分的代謝一致，致使循環吸收和消除相半衰期延長。但桑葉是一種無毒副作用的傳統中藥材，血漿中長時間較高的藥物濃度，更有利于其生物利用度的提高和藥效作用。

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