結直腸癌和息肉中Caspase通路上基因表達水平

潘益峰，張明五，金明娟，張善春，陳 坤，李其龍，馬新源，姚開顏，余運賢

(1.浙江大學公共衛生學院流行病學與衛生統計學系，浙江 杭州 310058;2.浙江省嘉善縣腫瘤防治所，浙江 嘉善 314100)

結直腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，近年來發病率以每年4.71%的速度遞增，每年新增病例已經超過17萬。根據中國國家癌癥數據庫資料顯示，在1991年－2005年期間結直腸癌是中國人群中發病率上升速度最快的三大惡性腫瘤之一［1］。許多研究已證明，結直腸息肉與結直腸癌的發生密切相關，結直腸息肉具有一定癌變傾向，尤其是腺瘤性息肉。

研究表明，結直腸癌的發生是一個十分復雜的、涉及多個因素參與的過程，不僅和細胞過度增生有關，也和細胞凋亡減少密切相關。Caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，目前發現［2］，該家族至少有14種Caspase在細胞凋亡中發揮作用，根據其功能不同，可分為三類，第一類為凋亡始動子，包括 Caspase-2、-8、-9、和-10等，能在其它蛋白參與下發生自我活化并激活下游Caspase。第二類為凋亡效應子，包括Caspase-3、-6和-7，能被上游的始動子激活，激活后作用于特異性底物使細胞發生分化及形態學改變，導致細胞凋亡。第三類包括Caspase-1、-4、-5和-13等，主要參與細胞因子介導的炎癥反應，并在死亡受體介導的細胞凋亡途徑中起輔助作用。近年來，國內外做了大量有關Caspase表達與癌癥發生的研究，發現在不同的腫瘤細胞中，同一Caspases基因的表達變化并不一致，而且即使在同一腫瘤細胞中也存在不同Caspases基因的表達。Caspase-3在結直腸癌、肝細胞癌、胃癌等［3-5］多種腫瘤組織中的表達是明顯降低的;而在乳腺癌組織中呈過表達狀態［6］。本研究以結直腸癌高發區浙江省嘉善縣作為研究現場，利用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，檢測結直腸正常黏膜-結直腸息肉-結直腸癌序列中Caspases凋亡通路上相關基因的mRNA表達，旨在探索其在結直腸癌發生發展中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象 本研究以在浙江省嘉善縣腫瘤所就診并進行結腸直腸鏡檢查者為研究對象。采用病例對照研究設計，結直腸癌及息肉均經病理組織確診;正常對照則來源于在腫瘤所進行結腸或直腸鏡檢測的非結腸或直腸疾患者。在2008年－2010年期間，收集了結直腸癌組織19例、結直腸息肉組織86例及正常結直腸黏膜10例。通過問卷調查方式收集了研究對象的基本人口學特征(年齡、性別、職業和文化水平)、吸煙和飲酒等相關資料。

1.2 mRNA 檢測方法

1.2.1 RNA分離純化 采用 Trizol(Invetrogen)試劑盒分離純化組織中的總RNA，具體流程參考試劑說明書，采用核酸定量儀檢測總RNA的濃度和純度。

1.2.2 cDNA的合成 取2～5 μg總RNA 進行逆轉錄反應，反應體系:2×RT Enzyme mix 10 μl，Oligo dT 引物1.0 μl，最后用RNAse free 水將反應體系調整至20 μl;反應條件:37℃、60 min，5℃、5 min，結束后凍存于－20℃保存備用。

1.2.3 實時熒光定量 PCR檢測目的基因mRNA的表達水平 采用SYBR Green熒光實時定量PCR試劑盒檢測目的基因和內參的擴增曲線。PCR的反應體系:SYBR Premix 5 μl，上下游引物各 1 μl(10 μmol/L)，cDNA 0.8 μl，用雙蒸水將體系調整至10 μl，進行熒光定量PCR反應。在相同的條件下(模板及反應條件)擴增Caspase基因和內參片段，分析其擴增曲線，得到各個目的基因和內參基因的Ct值，并對Ct值進行初步的處理和分析。

1.2.4 數據的轉換 根據熒光定量PCR檢測的原理和本研究的設計方法對得到的Ct值進行如下處理，目的基因的表達水平:特異性cDNA 的含量 =2－(Ctbeta-actin-Ct目的基因)。

1.3 統計分析 采用SAS 9.2統計軟件包進行數據統計分析。研究對象的人口學特征描述及比較:分類變量采用χ2檢驗，連續變量3組樣本間比較用方差分析;mRNA表達水平在3組間差異比較用方差分析和多元線性回歸。由于各Caspases基因的mRNA表達水平非正態分布，故做對數轉換(Ln)。采用多元線性回歸分析Caspases基因的mRNA表達水平在3組間差異時，調整的協變量包括研究對象的基本人口學特征(年齡、性別、職業和文化水平等)、吸煙和飲酒。各基因mRNA表達水平間相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05作為統計學有顯著性水平的標準。

2 結果

2.1 結直腸癌、息肉及正常黏膜組的基本人口學特征分布 本研究共收集19例結直腸癌組織(結直腸癌10例，直腸癌9例)，86例息肉組織和10例正常結直腸黏膜組織，其中男性72例，女性43例。結直腸組、息肉組及正常對照組的年齡、性別、組織部位、職業、吸煙和喝酒在各組間分布均衡(表1)。

2.2 結直腸癌、息肉及正常黏膜組中Caspase通路相關基因mRNA的表達水平比較 凋亡通路基因包括凋亡始動子Caspase-2、-8、-9、-10和凋亡效應子Caspase-3、-6、-7，單因素方差分析及多因素線性回歸分析結果表明，各Caspase mRNA在結直腸癌、息肉及正常黏膜組織中的表達水平沒有顯著性差異(P＞0.05)。經多因素校正之后，發現與正常黏膜組相比，Caspase-2、-6、-7、-8、-9 和-10 基因 mRNA 在結直腸癌組織中表達水平減少，而Caspase-3則在結直腸癌表達水平增加，但差異沒有統計學意義。盡管Caspase基因的表達水平3組間在統計學上沒有顯著性差異，但是，從表2看還是存在表達差異的趨勢，其中 Caspase-2、-6、-9和-10 基因mRNA在3種組織中的表達水平由高到低，依次為正常組織、結直腸癌組織、息肉組織;Caspase-3基因mRNA表達水平則是在癌組織中最高，息肉組織中最低;Caspase-7的表達水平由高到低依次為對照組織、息肉組織、結直腸癌組織;Caspase-8的表達水平則是在癌組織中最低，而在息肉中最高。多因素線性回歸分析結果表明，Caspase-3、-6、-7和-9基因 mRNA 表達水平在3組的分布未發生改變;Caspase-2、-8和-10基因mRNA表達水平則發生了改變:經校正后結直腸癌表達最低(表3)。

表1 結直腸癌組、息肉組及正常黏膜組織組的基本人口學特征分布Table 1 The distribution of socio－demographic characteristics in the three groups

表2 結直腸癌組、息肉組及正常黏膜組中各Caspase基因mRNA的表達(Ln)Table 2 The mRNA expression(Ln)of caspase apoptosis pathway genes in the three groups()

表2 結直腸癌組、息肉組及正常黏膜組中各Caspase基因mRNA的表達(Ln)Table 2 The mRNA expression(Ln)of caspase apoptosis pathway genes in the three groups()

基因 對照組(n=10)息肉組(n=86)結直腸癌組(n=19)P±2.783 0.7944 Caspase-3 －0.003 ±1.425 －0.383 ±2.068 0.196 ±2.862 0.5542 Caspase-6 7.172 ±3.278 5.471 ±3.757 6.039 ±4.281 0.3818 Caspase-7 0.469 ±2.335 －0.627 ±2.091 －0.678 ±2.516 0.3149 Caspase-8 －1.072 ±1.882 －1.069 ±1.983 －1.327 ±1.862 0.8896 Caspase-9 －5.605 ±1.715 －6.751 ±3.059 －6.651 ±2.815 0.5087 Caspase-10 －0.788 ±2.464 －1.975 ±2.478 －1.90 Caspase-2 －0.634 ±2.546 －1.247 ±2.702 －1.1905 ±2.566 0.3655

表3 各Caspase基因mRNA表達(Ln)多元線性回歸分析Table 3 The associations of polypus and colorectal cancer with caspase pathway genes mRNA(Ln)

2.3 各Caspase基因mRNA表達相關性分析結果 分別在正常黏膜對照組、息肉組及結直腸癌組對各Caspase基因mRNA表達水平進行兩兩相關分析，結果表明:在息肉組和結直腸癌組中 Caspase-2、-3、-6、-7、-8 和-10 之間存在高度正相關，相關系數均大于0.7，并且均具有統計學意義(P＜0.0001)，而 Caspase-9與其它Caspase通路相關基因均無相關(除在息肉組中Caspase-9與 Caspase-6之間存在弱相關 r=0.229，P=0.0442)。而在正常黏膜對照組未發現這一趨勢(表4～表6)。

表4 各Caspase基因mRNA表達(Ln)在正常對照組的相關性分析Table 4 The analysis of correlations of caspase apoptosis pathway genes mRNA(Ln)in normal control group

表5 各Caspase基因mRNA表達(Ln)在息肉組的相關性分析Table 5 The analysis of correlations of caspase apoptosis pathway genes mRNA(Ln)in polypus group

表6 各Caspase基因mRNA表達(Ln)在癌癥組的相關性分析Table 6 The analysis of correlations of caspase apoptosis pathway genes mRNA(Ln)in colorectal cancer group

3 討論

本研究結果發現，Caspase凋亡通路基因的表達水平在正常腸黏膜、結直腸癌和息肉組織中的沒有顯著性的差異，但是除Caspase-9外，發現其它選擇的Caspase基因在腫瘤組織的表達水平呈顯著的高強度兩兩正相關關系。

腫瘤的發生不僅與細胞過度增殖有關，而且與細胞凋亡密切相關。Caspase蛋白酶解級聯反應在細胞凋亡的發生與發展中起關鍵作用，被認為是細胞凋亡的中心環節和執行者［7］。Caspase-8和-10是死亡受體介導通路(外在通路)的凋亡始動子，兩者所起的作用相似，均能激活下游Caspase，它們在染色體上定位于2q33-34，可能是來自同一祖先基因的復制子［8］。本研究未發現Caspase-8和-10的mRNA表達水平在結直腸癌組織與正常對照組織中存在顯著差異。一項免疫組化研究顯示:結腸癌細胞中Caspase-8蛋白水平與正常對照組比較沒有明顯差異［9］;Xu 等［10］的研究也發現，Caspase-8的mRNA表達水平與正常的直腸黏膜組織比較沒有明顯差異。但是，在直腸腺瘤和直腸癌組織中Caspase-10的mRNA表達水平均下降，這與本研究的結果不一致。Caspase-9是線粒體介導通路(內在通路)的凋亡始動子，在細胞凋亡中發揮重要的作用。在胚胎形成過程中，Caspase-9表達缺失的老鼠，其中樞神經系統存在明顯的凋亡缺陷。本研究檢測了3種結直腸組織中的Caspase-9基因mRNA的表達水平，結果未發現存在顯著性差異。但有研究顯示［9］，結腸癌細胞中Caspase-9蛋白表達水平明顯下降。Caspase-3、-6和-7是凋亡內在通路及外在通路共同的效應子，其中Caspase-3是最重要的凋亡效應子。同樣，本研究也未發現這3個基因的表達水平在結直腸癌組織與正常對照組織中存在差異。

從DNA-mRNA-蛋白質過程中存在三個層次的調節，即轉錄水平調控，翻譯水平調控和翻譯后水平調控。本研究未發現Caspase-凋亡通路基因mRNA的表達在腫瘤發展過程中發生顯著變化，一方面可能是Caspase基因mRNA翻譯水平的調控，即對mRNA轉錄產物進行的選擇性剪接，導致 Caspase蛋白功能發生改變［11］。蛋白質是一切生命的物質基礎，是生理和病理功能的執行者，是生命現象的直接體現者，對蛋白質表達水平和功能的研究將直接闡明其在結直腸癌發生過程中的作用。從mRNA角度考慮，實際上只是從轉錄水平方面進行探討，并不能完全代表蛋白表達水平。而且蛋白質復雜的翻譯后修飾、蛋白質的亞細胞定位或遷移、蛋白質-蛋白質相互作用等幾乎無法從mRNA水平來判斷。本研究未能發現Caspase凋亡通路基因的表達水平在正常腸黏膜、結直腸癌和息肉組織中存在差異，或許mRNA水平不一定體現得出差異，以后的研究有必要同時檢測 Caspase凋亡通路的 mRNA表達水平、Caspases酶原形式及活化型蛋白的表達水平，來共同探討Caspase凋亡通路基因是通過哪個環節影響結直腸癌的形成的。

此外，本研究還做了Caspases凋亡通路各基因mRNA表達之間的相關分析，結果表明，大部分上下游Caspases基因mRNA的表達在腫瘤組織中存在強正相關，而在息肉和正常組織中沒有發現這種相關關系，提示各Caspases基因在腫瘤的發生過程中相互作用，相互促進。體外實驗也表明，Caspase-10能夠激活下游凋亡效應子 Caspase-3和-7［10］。因此，從機制學角度也能說明上下游Caspases基因mRNA的表達存在正相關。Wang等［12］報告 Caspase-8和Caspase-10能夠彼此交叉抑制，在死亡受體通路中緊密相關。本研究還發現在正常對照組中Caspase-9與Caspase-3基因mRNA的表達呈高度正相關，而在息肉組和癌癥組均未發現此相關，但Caspase-9基因與Caspase通路其它相關基因表達水平間均不相關。Caspase-9是內在凋亡通路的重要的始動子，而Caspase-3則是兩條通路最重要的共同效應子，以上結果提示在結直腸癌形成過程中，可能兩條凋亡相關通路所起的作用不同，以Caspase-8為始動子的受體介導的通路(外在通路)可能在結直腸癌致癌過程中起到主要作用。有關Caspases凋亡通路各基因與結直腸癌的發生發展及機制有待進一步研究。

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