P16INK4A和生存素在宮頸鱗狀細胞瘤樣變和宮頸鱗癌中表達的臨床意義

陶鳳喜

(聊城市第三人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 聊城 252000)

宮頸癌是女性人群中第二大常見的惡性腫瘤，防治宮頸癌的方法就是早發(fā)現(xiàn)和早治療，目前利用細胞學涂片篩查宮頸癌前病變很大程度減低了宮頸癌的發(fā)病率和致死率。然而，由于其單純的細胞學篩查有很高的假陰性率而不能充分的檢測宮頸癌前病變狀態(tài)。P16INK4A基因是人們發(fā)現(xiàn)的一種直接作用于細胞周期，抑制細胞分裂的抑癌基因，生存素是凋亡抑制基因，其過度表達可以抑制內(nèi)源性或外源性凋亡途徑介導的細胞死亡[1]。本研究探討用P16INK4A和生存素作為區(qū)分CIN的不同分級病變和宮頸癌(SCC)的可行性。

1 材料和方法

1.1 材 料

通過回顧性研究2005年1月～2010年5月因?qū)m頸病變來聊城市第三人民醫(yī)院行宮頸活檢或手術的201例患者，年齡(57±12)歲,宮頸組織標本包括組織活檢、宮頸錐形組織活檢、移形帶大部分環(huán)形切除標本和整個子宮全切標本，均經(jīng)病理結(jié)果證實，其中包括60例CIN1,21例CIN2,48例CIN3和72例SCC。CIN 1～3級為宮頸不典型增生，CIN 1 級細胞異型性輕，異型細胞僅占上皮層的下1/3；CIN 2級細胞異型性明顯，異型細胞限于上皮層的下2/3；CIN 3級細胞異型性顯著，異型細胞幾乎累及或全部累及上皮層。同期收治正常的宮頸組織10例作為對照組。

1.2 免疫組織化學方法

所有宮頸組織標本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法)進行免疫組織化學染色。鼠抗人p16蛋白單克隆抗體/鼠抗人生存素單克隆抗體、SP工作試劑盒購自上海尚寶生物科技有限公司。3，3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(Diaminobenzidin，DAB)顯色試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.3 結(jié)果判定

在光學顯微鏡下對涂片染色情況進行評估。P16INK4A光鏡下陽性物質(zhì)位于細胞核內(nèi)，亦可在胞質(zhì)，以細胞核染成棕色或棕黃色為陽性。在目標區(qū)隨即選5個高倍鏡計數(shù)視野內(nèi)陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比，<5%者為陰性表達， >5%而<50%為局灶或分散的陽性， >50%為彌散陽性[2]。所有結(jié)果均與病人的活檢標本或手術切除標本病理診斷相對照。生存素反應性判讀：生存素的表達依靠染色強度分為2種類型：陰性：沒有染色細胞或分散的弱染色細胞；陽性：分散的中等強度染色細胞或所有細胞重度染色且分布于整個視野。

1.4 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學處理采用χ2檢驗；Spearman等級相關分析做相關性檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 P16INK4A的表達

P16INK4A在所有正常的宮頸組織中未染色；CIN病變鄰近正常組織也沒有表達P16INK4A，P16INK4A在CIN1、CIN2、CIN3及SCC表達分別為25.0%、42.9%、85.8%、97.2%；見表1。P16INK4A在CIN3中的表達見圖1，陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比>50%。P16INK4A表達與CIN病變分級程度具有正相關性(r=0.478,P<0.05)。

表1 P16INK4A和生存素在正常宮頸組織、CIN不同病變階段及SCC的表達情況

圖1 P16INK4A在CIN3中染色表達(×100)

2.2 生存素的表達

生存素在CIN1、CIN2、CIN3、SCC表達分別為56.7%、33.3%、67.5%及97.2%，見表1。其中在CIN3和SCC表達差異有顯著性意義(P<0.05)。生存素在CIN3中染色表達見圖2,分散的中等強度染色細胞或所有細胞重度染色且分布于整個視野。

圖2 生存素在CIN3中染色表達(×100)

3 討 論

研究證明，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與高危型HPV感染(HPV16、18)直接相關。P16INK4A反映HPV感染的類型，是預測CIN病變結(jié)局的合適的標記。P16INK4A基因是在人染色體9p21發(fā)現(xiàn)的第一個直接參與細胞周期調(diào)控的抑癌基因,p16蛋白可與細胞周期素d競爭結(jié)合細胞周期依賴性激酶(cdk4)，使cdk4失活，從而阻止rb的磷酸化，去磷酸化的rb以活性形式結(jié)合e2f及atf2等轉(zhuǎn)錄因子，阻止細胞從G1期進入S期[3]。HPV16 癌基因產(chǎn)物E7 蛋白使Rb 失活從而導致轉(zhuǎn)錄因子E2F活性升高，CDK-Rb-E2F 調(diào)控途徑被阻斷,導致抑癌基因INK4產(chǎn)物P16INK4A大量積累和高表達。在瑞典對HPV感染的五年隨訪研究發(fā)現(xiàn)HPV16和HPV18是導致CIN2或CIN3的最大潛在病變的危險因素[4]。

本文研究顯示，P16INK4A隨著CIN病變分級升高，陽性表達明顯增加，與CIN病變分級程度具有相關性(r=0.478,P<0.05)。在97.2%SCC病變中過度表達，進一步證實HPV感染和宮頸癌之間的因果關系密切。然而，少數(shù)宮頸癌患者不表達P16INK4A。Nieh等[5]研究顯示一定比例宮頸癌患者即沒有HPV感染也沒有P16INK4A的表達，對于在SCC病變中P16INK4A缺失表達可能解釋為P16INK4A啟動子甲基化導致P16INK4A基因沉默不表達。同時，本文研究顯示所有正常宮頸鱗狀上皮細胞弱生存素染色，在CIN3與SCC病變中陽性表達例數(shù)差異有顯著性意義(P<0.05)，可作為鑒別宮頸病變程度的指標之一。Branca等[6]研究發(fā)現(xiàn)當活檢組織CIN為持續(xù)陰性時，生存素過度表達是存在CIN的特異性指標。

利用P16INK4A染色表達強度與CIN病變分級具有正相關性，生存素能用于區(qū)分CIN和SCC，因此在臨床診斷困難的情況下，可聯(lián)合檢測P16INK4A和生存素作為診斷CIN病變分級及SCC的輔助指標之一。

參考文獻：

[1] Grossman D，Kim PJ，Blanc-Brude OP，et al.Transgenic expression of survivin in keratinocytes counteracts UVB-induced apoptosis and cooperates with loss of p53[J].J Clin Invest，2001，108(7):991-999.

[2] Redman R，Rufforny I，Liu C，et al.The utility of p16(Ink4a)in discriminating between cervical intraepithelial neoplasia 1 and nonneoplastic equivocal lesions of the cervix[J].Arch Pathol Lab Med，2008，132:795-799.

[3] Khoo CM,Carrasco DR,Bosenberg MW,et al.INK4a/Arf tumor suppressor does not modulate the degenerative conditions or tumor spectrum of the telomerase-deficient mouse[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(10):3931-3936.

[4] Schlecht NF，Kulaga S，Robitaille J，et al.Persistent human papillomavirus infection as a predictor of cervical intraepithelial neoplasia[J].JAMA，2001，286(24):3106-3114.

[5] Nieh S，Chen SF，Chu TY，et al.Is p16INK4Aexpression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undetermined significance-categorized Pap smear? A comparative analysis using abnormal cervical smears with follow-up biopsies[J].Gynecol Oncol，2005，97(1):35-40.

[6] Branca M，Ciotti M，Santini D， et al.p16INK4Aexpression is related to grade of cin and high-risk human papillomavirus but does not predict virus clearance after conization or disease outcome[J].Int J Gynecol Pathol，2004，23(4):354-365.