補(bǔ)體C3、C4在復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制中作用的探討

張新宇，李晶晶

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116011； 2.河南科技大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 洛陽 471003)

隨著臨床免疫學(xué)的發(fā)展，免疫因素在自然流產(chǎn)中的作用日益受到關(guān)注。本研究通過檢測復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn) (recurrent spontaneous abortion，RSA) 患者血清和絨毛組織中補(bǔ)體C3、C4水平，以探討補(bǔ)體C3、C4在RSA致病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2009年6月～2010年2月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診，有RSA史的患者30例為研究組。其中，15例未孕者為研究組Ⅰ，平均年齡(31.6±4.5)歲，孕次(2.9±0.8)次，就診時(shí)間距末次流產(chǎn)時(shí)間均>6個(gè)月；15例就診時(shí)診斷為難免流產(chǎn)者，列為研究組Ⅱ，平均年齡(30.5±4.2)歲，孕次(2.7±1.3)次，平均孕齡(61.0±11.1)d。選取同期就診無自然流產(chǎn)史的女性30例為對照組。其中，15例為健康體檢的已婚女性，列為對照組Ⅰ；15例為正常早期妊娠要求行人工流產(chǎn)者，為對照組Ⅱ。兩組平均年齡、孕次及孕齡差異均無顯著性意義。所有入選對象均已排除夫妻雙方染色體異常、內(nèi)分泌疾病、血型不合、感染、男方精液異常等因素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

兩組患者空腹時(shí)經(jīng)肘靜脈采血3 mL，分離出血清后置于-80℃冰箱中凍存，采用電化學(xué)發(fā)光免疫法測定血清標(biāo)本補(bǔ)體C3、C4值；于清宮術(shù)和人工流產(chǎn)術(shù)中獲得研究組Ⅱ和對照組Ⅱ絨毛組織，制備成石蠟切片，采用快捷型免疫組織化學(xué)法測定蛻膜和絨毛組織補(bǔ)體C3、C4蛋白表達(dá)，并按照陽性范圍和陽性強(qiáng)度進(jìn)行半定量評分[1]：無陽性著色的細(xì)胞為0分，陽性范圍<25%為1分，26～50%為2分，51～75%為3分，>75%為4分；陽性強(qiáng)度弱(低倍鏡下可疑陽性，高倍鏡下明確陽性)為1分，陽性強(qiáng)度中等(低倍鏡下陽性)為2分，強(qiáng)陽性(低倍鏡下明確陽性)為3分，極強(qiáng)陽性(低倍鏡下強(qiáng)陽性)為4分。將著色范圍的計(jì)分與著色強(qiáng)度的計(jì)分相乘作為總計(jì)分，總計(jì)分0分為陰性；1～3分為弱陽性；4～9分為陽性；≥10分為強(qiáng)陽性。陽性范圍和強(qiáng)度的評分相乘，即為該例的陽性積分；每組陽性積分總和除以例數(shù)，為該組陽性強(qiáng)度平均積分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 血清補(bǔ)體C3、C4測定結(jié)果

研究組血清C3、C4值明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。研究組Ⅱ血清C3、C4值明顯高于對照組Ⅱ(P<0.05)，見表2。

表1 研究組和對照組血清C3、C4測定結(jié)果

表2 各組間血清C3、C4測定結(jié)果

2.2 絨毛中補(bǔ)體C3、C4的表達(dá)部位

研究組Ⅱ絨毛組織可見補(bǔ)體C3在合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿都有大量表達(dá)(圖1)；對照組Ⅱ絨毛組織可見補(bǔ)體C3少量表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，間質(zhì)細(xì)胞無表達(dá)(圖2)。

研究組Ⅱ絨毛組織補(bǔ)體C4在合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿中都有大量表達(dá)(圖3)；對照組Ⅱ絨毛組織補(bǔ)體C4少量表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞漿，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞均無表達(dá)(圖4)。

2.3 補(bǔ)體C3、C4在絨毛組織表達(dá)的半定量分析

研究組Ⅱ補(bǔ)體C3和 C4表達(dá)均高于對照組Ⅱ(P<0.05)，見表3、表4。

圖1 研究組Ⅱ絨毛C3沉積(IHC ×400)

圖2 對照組Ⅱ絨毛C3沉積(IHC ×400)

圖3 研究組Ⅱ絨毛C4沉積(IHC ×400)

圖4 對照組Ⅱ絨毛C4沉積(IHC ×400)

表3 補(bǔ)體C3在絨毛組織表達(dá)的半定量分析

Tab 3 The semiquantitative analysis result of complement C3 express in villus

表3 補(bǔ)體C3在絨毛組織表達(dá)的半定量分析

組別總例數(shù)強(qiáng)陽性陽性弱陽性陽性強(qiáng)度平均積分研究組II158(53.3)6(40.0) 1(6.7)10.1±4.9對照組II1505(33.3)10(66.7) 2.2±1.4

表4 補(bǔ)體C4在絨毛組織表達(dá)的半定量分析

Tab 4 The semiquantitative analysis result of complement C4 express in villus

表4 補(bǔ)體C4在絨毛組織表達(dá)的半定量分析

組別總例數(shù)強(qiáng)陽性陽性弱陽性陽性強(qiáng)度平均積分研究組Ⅱ156(40.0)4(26.7) 5(33.3)6.6±5.3對照組Ⅱ1502(13.3)13(86.7)1.7±1.0

3 討 論

補(bǔ)體是存在于人體和動(dòng)物血清、組織液，經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，在病原體微生物入侵或異體抗原存在時(shí)，補(bǔ)體的各成分便照一定的順序發(fā)生酶促反應(yīng)，形成放大的級聯(lián)效應(yīng)，稱為補(bǔ)體激活。補(bǔ)體激活能直接損傷滋養(yǎng)細(xì)胞，補(bǔ)體激活后產(chǎn)生的裂解成分，能夠使中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞聚集并活化，進(jìn)一步對胚胎組織造成損傷[2]。補(bǔ)體的這種生理特性，使其在細(xì)胞免疫和體液免疫介導(dǎo)的胎兒損傷中發(fā)揮重要作用。在人體中C3含量最高，C4僅次于C3，C3在補(bǔ)體系統(tǒng)激活過程起著樞紐作用[3]。

3.1 補(bǔ)體與正常妊娠

在生理?xiàng)l件下，補(bǔ)體激活能夠產(chǎn)生一系列補(bǔ)體裂解片段，這些裂解片段能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞趨化，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬作用，使機(jī)體抵御病原體能力增強(qiáng)，保護(hù)正常妊娠，但是母體胎兒界面上過度的、不受調(diào)控的補(bǔ)體激活能夠?qū)е绿核劳鯷4]。正常妊娠婦女體內(nèi)也有潛在的補(bǔ)體激活，但是卻沒有發(fā)生自然流產(chǎn)，這是因?yàn)轶w內(nèi)存在一系列調(diào)節(jié)蛋白，稱為補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(Regulator of complement activation,RCA)，RCA主要有三種：膜輔助蛋白、衰變加速因子和保護(hù)素，它們是機(jī)體為逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的自身同源殺傷而分泌的一系列結(jié)合蛋白，能夠協(xié)同調(diào)控補(bǔ)體轉(zhuǎn)化酶的組裝和穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)生理狀態(tài)下的補(bǔ)體激活[5]。在正常妊娠狀態(tài)下，胎盤不易受到補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫損傷，其補(bǔ)體激活也不容易被直觀的監(jiān)測，因?yàn)镽CA能夠調(diào)節(jié)正常狀態(tài)下的補(bǔ)體激活，使補(bǔ)體激活狀態(tài)在短時(shí)間恢復(fù)平衡[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：正常早期妊娠者血清補(bǔ)體C3、C4值和正常未妊娠者血清補(bǔ)體C3、C4值相比差異無顯著性意義 (P>0.05)，說明正常妊娠狀態(tài)下，補(bǔ)體激活處于機(jī)體可調(diào)控范圍內(nèi)，這可能與RCA的作用密切相關(guān)，使妊娠得以維持。

3.2 補(bǔ)體與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)

有研究表明有復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)史的婦女，妊娠即將流產(chǎn)時(shí)，血清補(bǔ)體C3、C4水平較正常妊娠婦女顯著升高，有學(xué)者提出補(bǔ)體顯著升高是RSA婦女即將流產(chǎn)的預(yù)警器[7]，因此有學(xué)者提出在免疫因素所致的胎兒損傷中，補(bǔ)體機(jī)制處于中心地位[8]。Holers VM等[9]研究發(fā)現(xiàn)：利用C3轉(zhuǎn)化酶抑制劑或應(yīng)用基因技術(shù)去

除孕鼠補(bǔ)體C3的表達(dá)基因，能夠避免孕鼠發(fā)生抗磷脂抗體介導(dǎo)的妊娠丟失和胎兒宮內(nèi)生長受限。抗磷脂抗體通過補(bǔ)體經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生C3a、C5a等補(bǔ)體裂解片段，這些裂解片段能吸引炎癥細(xì)胞聚集至胚胎組織，例如單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。炎癥細(xì)胞的聚集從而引起補(bǔ)體旁路途徑的激活，引起補(bǔ)體激活級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生補(bǔ)體過度激活反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)一步引起炎癥細(xì)胞聚集，形成促炎癥反應(yīng)環(huán)。一些研究發(fā)現(xiàn)胚胎死亡的孕婦體內(nèi)補(bǔ)體水平明顯高于正常孕婦，認(rèn)為這一結(jié)果導(dǎo)致母體血液中產(chǎn)生了大量的補(bǔ)體C3，大量的炎癥細(xì)胞聚集至胚胎組織，從而導(dǎo)致胚胎死亡[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)：難免流產(chǎn)者血清補(bǔ)體C3、C4值顯著高于正常妊娠者(P<0.05),說明難免流產(chǎn)者體內(nèi)出現(xiàn)了補(bǔ)體水平異常情況，補(bǔ)體存在過度激活的可能性，與上述作者研究結(jié)果一致，由此推測補(bǔ)體過度激活可能是RSA的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制之一。

3.3 補(bǔ)體在絨毛組織中的表達(dá)意義

免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為補(bǔ)體在組織中的表達(dá)，意味著出現(xiàn)了補(bǔ)體激活。Jaime M等[12]用免疫組織化學(xué)的方法對47例抗磷脂抗體綜合征產(chǎn)婦和29例正常妊娠產(chǎn)婦的胎盤補(bǔ)體C3、C4沉積量進(jìn)行研究：研究發(fā)現(xiàn)兩組胎盤均有補(bǔ)體表達(dá)，但是前者胎盤中補(bǔ)體C3、C4表達(dá)量顯著大于后者，補(bǔ)體C3表達(dá)于胎盤絨毛細(xì)胞的細(xì)胞漿中，補(bǔ)體C4表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和基底膜的細(xì)胞漿中。Asherson RA等[11]認(rèn)為RSA患者機(jī)體產(chǎn)生了大量的補(bǔ)體C3，同樣也伴隨著補(bǔ)體C3大量沉積于靶組織，胚胎組織是補(bǔ)體沉積的靶目標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：難免流產(chǎn)絨毛組織補(bǔ)體C3大量表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿；補(bǔ)體C4大量表達(dá)于以上三種細(xì)胞的細(xì)胞漿。正常妊娠絨毛組織補(bǔ)體C3主要表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，補(bǔ)體C4主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞漿。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色范圍進(jìn)行半定量評分，難免流產(chǎn)絨毛組織中補(bǔ)體C3、C4表達(dá)顯著高于正常妊娠絨毛組織(P<0.05)，這一結(jié)果與Jaime M等[12]研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)正常妊娠絨毛組織也存在補(bǔ)體C3、C4沉積，說明正常妊娠狀態(tài)下也存在一定程度的補(bǔ)體激活，補(bǔ)體激活程度在機(jī)體可調(diào)控的范圍內(nèi)，并沒有發(fā)生大范圍組織損傷，因此妊娠可

以繼續(xù)。難免流產(chǎn)者絨毛組織補(bǔ)體C3、C4表達(dá)顯著增高，進(jìn)一步驗(yàn)證了此類患者體內(nèi)存在補(bǔ)體過度激活，但是補(bǔ)體成分為何會(huì)沉積于這些部位，目前尚無報(bào)道，仍待后續(xù)研究。

通過以上實(shí)驗(yàn)推測：補(bǔ)體過度激活可能是RSA的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制之一。根據(jù)這種推測，在不遠(yuǎn)的將來，抑制補(bǔ)體激活的治療方法有望為不明原因的RSA患者提供新的、更合理、更有效的治療。

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