小鼠腹水型肝癌高低轉移細胞株DARS2蛋白表達的差異

吳學標，胡 軍，宋 陽，宮琳琳

(大連醫科大學 組織胚胎學教研室，遼寧 大連 116044)

DARS2蛋白，即線粒體天冬氨酰-tRNA 合成酶2(AspRS2)是Scheper GC 等2007年確定的，與腦干脊髓白質病變及乳糖增高癥相關[1]，與腫瘤的相關性尚未見報道。本實驗研究DARS2蛋白在具有高、低淋巴道轉移潛能的小鼠腹水型肝癌細胞株Hca-F、Hca-P中的表達差異，以期發現新的肝癌轉移相關蛋白。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗對象：具有高、低淋巴道轉移潛能的小鼠腹水型肝癌細胞株Hca-F、Hca-P，由大連醫科大學病理教研室篩選提供，本實驗室長期凍存。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，RPMI 1640培養基(Gibcobrl公司)，ECL試劑盒(Amersham Biosciences公司)，PVDF膜(Pall公司)，兔抗小鼠DARS2多克隆抗體(Protein Tech Group公司)，羊抗兔IgG(Santa公司)，免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：復蘇凍存的細胞，分別將Hca-F，Hca-P細胞接種615小鼠腹腔，7 d無菌條件下抽取腹水，以PBS緩沖液洗滌1次，將細胞培養在含10%的胎牛血清，RPMI 1640培養基中(含青霉素100 μg/mL，鏈霉素100 μg/mL)，在37 ℃、飽和濕度及5% CO2的培養箱中培養24 h，使巨噬細胞貼壁，收集未貼壁細胞即Hca-F細胞、Hca-P細胞備用。

1.2.2 免疫印跡分析：分別提取Hca-F細胞及Hca-P細胞的總蛋白；取上清液倍比稀釋，用考馬斯亮藍染色，于波長595 nm處測吸光度。分別將相同含量的蛋白樣品和上樣緩沖液以體積比1∶1的比例混合，水中煮沸5 min，使蛋白質變性，以每孔30 μg的蛋白含量點樣，經10%SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，分別加DARS2一抗(1∶500)室溫搖床孵育3 h，用TBS緩沖液洗4次，10 min/次，加入二抗(1∶1000)室溫搖床孵育2 h，再用TBS緩沖液洗滌3次，10 min/次。加入發光試劑(ECL)顯色。以β-actin作內參照。用圖像分析軟件計算出每個蛋白條帶的積分光密度；計算出目的條帶積分光密度/對應內參條帶積分光密度的比值，該值即可反映對應樣品內目的蛋白的相對含量。

1.2.3 免疫細胞化學實驗：分別離心收集Hca-F細胞及Hca-P細胞，制成細胞涂片，入80 ℃烘箱中烤片3 h；純丙酮固定20 min；0.1%Tritou X-100孵育30 min；H2O2孵育15 min；正常動物血清封閉10 min；滴加一抗，濕盒中4 ℃孵育過夜；PBS洗3次；滴加二抗，室溫孵育20 min。以上各步驟間均以PBS洗3次。DAB顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察結果并拍照。陽性表達可見棕黃色沉淀物。

1.3 統計學方法

所有實驗結果均來自至少3組平行或3次重復實驗。數據由SPSS 10.0軟件進行統計學分析。本實驗所涉及的兩組實驗數據比較采用t檢驗分析，數值用 mean±SD 表示，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結 果

2. 1 免疫印跡分析細胞中DARS2蛋白的表達

經免疫印跡分析檢測DARS2蛋白的表達情況。通過圖像分析軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，與β-actin內參照相比，DARS2蛋白的相對含量在小鼠腹水型肝癌高轉移細胞株Hca-F中的表達中僅為0.219±0.016，明顯低于低轉移細胞株Hca-P 細胞的0.473±0.043(圖1)。差異有顯著性意義(P=0.01)。

圖1 免疫印跡分析DARS2蛋白表達

2.2 免疫細胞化學方法檢測細胞中DARS2蛋白的表達

經免疫細胞化學方法進一步檢測DARS2蛋白的表達情況。結果顯示DARS2蛋白在小鼠腹水型肝癌高轉移細胞株Hca-F及低轉移細胞株Hca-P 細胞中均有表達，但在高轉移細胞株Hca-F細胞中表達較少；在低轉移細胞株Hca-P細胞中表達較多，表達主要定位于細胞質中，顯示較強的棕黃色沉淀物(圖2)。結果與免疫印跡分析一致，進一步證實了DARS2蛋白在小鼠腹水型肝癌高轉移細胞株Hca-F中的表達明顯低于低轉移細胞株Hca-P 細胞。

3 討 論

線粒體是細胞能量代謝中心。若線粒體受到損傷，則會影響整個細胞的正常功能。近年，線粒體與腫瘤之間的聯系已引起了專家學者的普遍關注。國內外已在乳腺、肺、胃、肝、胰、結腸、腎、膀胱、前列腺、甲狀腺和卵巢等處的惡性腫瘤中都發現了線粒體DNA突變。

最近的研究結果表明，線粒體內的蛋白質翻譯機器的組成成分——氨基酰-tRNA 合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase，AARS)與人類的疾病密切相關。AARS是一類古老的蛋白質家族，能催化tRNA 的氨基酰化反應，生成氨基酰，為蛋白質生物合成提供原料[2]。目前，已有研究表明人線粒體天冬氨酰-tRNA 合成酶(AspRS)基因上的一系列突變可導致其 mRNA 被快速降解或者蛋白質氨基酸一級結構發生改變，引起腦干脊髓白質病變及乳糖增高癥。研究者首先根據微衛星標記構建了來自30 個家庭的38 個患者的遺傳圖譜，在1 號染色體的一段特定區域發現了潛在的致病基因。對這一區域進行DNA 測序，發現了致病基因DARS2。DARS2位于染色體1q25.1，廣泛存在于睪丸、腦、未知功能組織、胚胎組織、胰臟、眼睛、腎臟、胎盤、前列腺、脾臟、肌肉、皮膚、肝、乳腺、子宮、卵巢、脂肪組織、淋巴結、膀胱、垂體、口、氣管、胃、腸、咽喉、肺、結締組織、唾液腺、腹水、胸腺、血管、神經、骨、骨髓、心臟等組織。該基因編碼線粒體AspRS，負責線粒體基因組遺傳密碼的解析。在這些患者的DARS2 中發現了一系列不同的點突變，包括無義突變、錯義突變和內含子序列突變。但是，健康個體的對照組(400～420個)的DARS2 中卻沒有任何突變，證實了DARS2基因的致病性[1-2]。隨后，有研究者相繼在DARS2中發現新的點突變，并證實DARS2基因突變可以作為腦干脊髓白質病變的診斷指標之一[3-7]。

圖2 免疫細胞化學方法檢測DARS2蛋白的表達 ×400

本研究以小鼠腹水型肝癌高、低轉移細胞株Hca-F和Hca-P為細胞模型，探討DARS2蛋白在這一對細胞株中的表達是否具有差異性。本實驗采用的動物模型為615型小鼠，因為在一般的小鼠中腹水型肝癌細胞并不能很好地增殖表達。Hca-F和Hca-P細胞是由腹水型肝癌細胞H22中篩選出的特異性淋巴道轉移的高低轉移株。其中，Hca-F細胞為高轉移株，Hca-P細胞為低轉移株，兩株細胞具有高度的同源性，是研究腫瘤轉移機理的較好模型。本實驗免疫印跡分析及免疫細胞化學方法檢測結果均顯示DARS2蛋白在腹水型肝癌高轉移細胞株Hca-F中的表達明顯低于低轉移細胞株Hca-P細胞；表達主要定位于細胞質中。結果提示，DARS2蛋白的表達降低可能與肝癌細胞轉移能力增強相關。DARS2可能由于發生了點突變而使DARS2蛋白的表達降低，進而使線粒體受到損傷，影響了細胞的生物學功能，提高了細胞的侵襲、遷移能力。DARS2與腫瘤的相關性目前尚未見報道，還有待于進一步的實驗研究。

參考文獻：

[1] Scheper GC, van der Klok T, van Andel R J, et al. Mitochondrial aspartyl-tRNA synthetase deficiency causes leukoencephalopathy with brain sten and spinal cord involvement and lactate elevation[J]. Nat Genet, 2007, 39(4):534-539.

[2] 周小龍, 王恩多.與人類疾病相關的幾種線粒體氨基酰-tRNA合成酶. 生物化學與細胞物理學進展[J]. 2008, 35(8):853-858.

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