小興安嶺地區主栽黑木耳品種的遺傳背景分析

馬珂，李滇華，邢振楠，王洪剛，楚金玉

（1.伊春原生態食用菌研究所，黑龍江 伊春 153000；2.黑龍江北方林業有限公司）

小興安嶺伊春地區是我國黑木耳的主產區之一，每年栽培量在4億袋以上。在黑木耳生產中菌種是基礎資料，是影響產品產量和質量的關鍵因素，優良菌種的選用對整個產業的發展起著重要的作用。由于不同地區和生產廠家頻繁相互引種，自主命名，造成生產用菌種命名極為混亂。

針對這一現象，本文采用酯酶同工酶電泳技術，對生物學特性適宜伊春地區栽培的、商品性較好、產量較高的23個黑木耳品種遺傳背景進行分析，對它們進行鑒別，同時也為今后的遺傳育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種及來源

從小興安嶺伊春地區收集得到23個黑木耳主栽品種，用于酯酶同工酶分析（見表1）。

1.2 設備

DYY-10電泳儀、WD-9412A恒溫循環器、DYCZ-28A電泳槽、HH-2數顯恒溫水浴鍋、HH-B11-600-S型電熱恒溫培養箱、TGL-16高速離心機、Gilson移液器、分析天平（精度0.01g、0.0001g各一臺）、研缽（備有研杵）等。

表1 供試菌種及其來源

1.3 試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、N，N-甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、核黃素、α－乙酸萘酯、β－乙酸萘酯、堅固藍RR鹽，以上試劑均購自Sangon（BBI分裝），其它試劑均為國產。

1.4 菌絲培養

1.4.1 培養基配方（LCYM）：葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸膏2g，硫酸鎂0.5g，磷酸氫二鉀1g，磷酸二氫鉀0.46g，蒸餾水定容1000mL。

1.4.2 培養條件：（25±1）℃避光，靜止在培養箱內培養20d。

1.5 酯酶同工酶檢測

1.5.1 樣品制備。準確稱取0.5g菌絲體，加入液氮研磨，將樣品收集于1.5mL離心管中，加入1.0mL樣品提取液，4℃下10000r／min離心10min，取其上清液與40%蔗糖溶液、溴酚藍指示劑按5∶1∶1的比例混合，混合液即為電泳樣品。

1.5.2 電泳檢測。向電泳槽中注用1×Tris－甘氨酸緩沖液，用微量進樣器取21μL電泳樣品樣品孔中，樣品先在穩壓100V的條件下進行電泳，待樣品進入濃縮膠后，把電泳槽放入冰箱內進行低溫電泳，待指示劑進入分離膠后，把電壓調到200V進行穩壓電泳，最后當溴酚藍指示劑距凝膠底部1cm時，停止電泳。

1.5.3 凝膠染色。倒出1×Tris－甘氨酸緩沖液，卸下膠條，于水中取出凝膠，浸入染色液，室溫下染色20min左右，用ddH2O沖洗凝膠，置于7%乙酸溶液中固定，照相（圖1、圖2）。

1.5.4 數據統計分析。根據電泳結果統計酯酶同工酶條帶，條帶的有無分別記為1和0，按Nei＆Li（1979）的方法計算各菌種之間的相似系數GS＝2Nij／（Ni＋Nj），式中Ni和Nj分別為I和J兩個菌種的總條帶數，Nij為兩材料的公共條帶數。獲得相似系數GS矩陣后，應用NTSYS 2.10e軟件進行聚類分析，構建遺傳相關聚類圖。

2 結果與分析

2.1 酯酶同工酶酶譜分析

如圖1、圖2所示各菌種之間的酶帶顏色和寬窄也有差異，可分為四級：一級酶帶：色深而寬；二級酶帶：色較深而寬；三級酶帶：色較淺而窄；四級酶帶：色很淺而窄。酶帶顏色和寬窄的變化說明了酯酶同工酶的活性和含酶量的差異，色深而寬的酶帶酯酶同工酶的活性強、含量高，色淺而窄的酶帶酯酶同工酶的活性弱、含量低。

供試23個菌種進行酯酶同工酶電泳分析。酯酶同工酶譜帶數在5～10條，共分離出14條遷移率（Rf）不同的多態性酶帶，遷移率在0.29～0.85，譜帶穩定，重復性高。

2.2 遺傳背景分析

根據電泳條帶的有、無，分別記為1或0，對穩定、清晰的酶帶進行統計，輸入計算機，采用NTSYS 2.10e分析軟件中的STMQUAL程序計算遺傳相似系數，并建立樹狀圖（圖3）。

由圖3可見，一品黑、A1、長城1號三個菌株間的相似系數達1.0；A8、A4、特產1號三個菌株間的相似系數達1.0；特產6號、A3、林科3號、長白7號、匯豐1號、8129六個間相似系數達1.0。

在遺傳相似系數0.62水平上，23個黑木耳菌種聚為為A、B兩大類，其中A類在遺傳相似系數0.78水平上聚為Ⅰ、Ⅱ兩大類，Ⅰ類包括以下品種：一品黑、A1、長城1號、A8、A4、特產1號、特產5號、特產2號、黑29、銀珠1號、特產6號、A3、林科3號、長白7號、匯豐1號、8129、特產15號共17個菌株；Ⅱ類品種：A15；其中B類在遺傳相似系數0.75水平上聚為Ⅲ、Ⅳ兩大類，Ⅲ類包括以下品種：友好918、北青、林科6號、特產3號共四個菌種；Ⅳ類品種：神龍A8。

圖1 供試黑木耳菌種（編號1～12）酯酶同工酶電泳圖譜

圖2 供試黑木耳菌種（編號13～23）酯酶同工酶電泳圖譜

圖3 23個黑木耳菌種PAGE-EST分析聚類樹狀圖譜

3 討論

隨著生物技術和食用菌產業的發展，同工酶電泳分析在食用菌遺傳學和菌種真實性鑒定中得到廣泛應用，其中以酯酶同工酶和過氧化酶的應用最多。在酯酶同工酶電泳試驗中，由于菌種的酯酶同工酶和其形態特征一樣都是菌種的基因型與環境效應相互作用的綜合表現的結果，所以酯酶的活性受到外部環境影響比較大，并且具有明顯的組織特異性等特點。因此，在應用其進行食用菌種質鑒定、品種鑒別等有關研究工作中，要采用標準化，在相同條件下進行分析，才能建立食用菌菌種的標準酶譜和保證酯酶同工酶的穩定性。

從供試菌種的酶譜帶型和聚類分析可以看出，部分菌種之間的帶型相似或者相同，相似系數也很高，甚至達到1.0，如一品黑、A1和長城1號；A8、A4和特產1號等一些品種可以初步確定這些菌種間親緣關系很近。由于菌絲代謝活動差異，酶的活性不同，酯酶同工酶的帶數和酶帶深淺、寬度等會出現差異，在酶帶實際統計分析中都會對分析結果產生影響，特別在聚類等分析中。在今后的研究中應當將PAGE-EST與ISSR、SRAP等標記技術相結合進行綜合分析。

本實驗表明，23個黑木耳菌種酯酶多態性比較高，共分離到不同遷移率的條帶14條，條帶類型比較豐富，多數菌種之間存在差異，在相同的實驗條件下（菌齡等因素），其穩定性和重復性比較好，并且在一定程度上可以反應出某些菌種之間存在同物異名現象。隨著《NY／T 1097-2006食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法》的頒布，酯酶同工酶電泳技術以其操作簡單、耗時短、費用低和重復性高等特點，在食用菌菌種的真實性鑒定和遺傳學等方面的研究依然有比較高的應用價值。

[1]邊銀丙，羅信昌，周啟.木耳栽培菌株酯酶同工酶的酶譜多樣性研究[J].菌物系統，2000，19（1）：87-90.

[2]胡能書，萬賢國.同工酶技術及其應用[M].長沙：湖南科學技術出版社，1985.96-99.

[3]王子迎，王書通.安徽野生香菇遺傳多樣性及雜種優勢的ISSR分析[J].菌物學報，2006，25（2）：211-216.

[4]肖楊，唐力華，邊銀丙.應用簡并引物擴增黑木耳信息素受體基因片段[J].菌物學報，2006，25（2）：316-320.