犬肝纖維化MR彌散加權成像及VEGF表達與病理對照研究

章雅琴，李從蕊，胡躍群，駱 雷，廖云杰，王 維

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發展的必經階段。肝纖維化的早期診斷及嚴重程度判定在慢性肝病的早期治療和預后判斷中有重要意義。以小動物如鼠、兔等為主的肝纖維化模型，肝臟體積小，耐受力差，死亡率高；且成模時間短，多在12～18周左右，與人類慢性肝病的致病過程有一定差別。在基于小動物模型肝纖維化形態學的傳統影像方法研究中，未發現比較敏感和特異的指標。

本研究擬利用中華田園犬模型模擬人慢性肝纖維化過程，在建立肝纖維化的過程中，動態進行肝臟DWI成像、血管內皮生長因子(VEGF)檢測并與常規病理結構改變進行對照分析；在肝纖維化動態改變過程中，從分子水平對其結構變化進行評價。對評價肝纖維化的指標進行探索，以期提高肝纖維化的影像診斷水平。

本實驗符合科學技術部2006年《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求[1]，已經過本院倫理委員會同意。

1 材料與方法

1.1 犬肝纖維化模型的制備

健康雄性中華田園犬，12只，體重9～12 kg，24月齡，普通喂養2周后，隨機分為2組，實驗組10只，對照組2只。實驗組腹腔注射50% CCl4植物油混合劑，注射劑量按0.125 ml/kg體重，每周2次；6月后根據動物的飲食、體重反應情況，劑量調整為0.15 ml/kg；高脂低蛋白喂養，以自來水為飲料。對照組采用普通喂養，腹腔注射相同劑量的生理鹽水，每周2次。每4周行MR掃描及肝穿刺活檢1次，共獲得48組動物肝臟與病理對照的資料。

1.2 MR掃描方法及圖像后處理

采用德國西門子公司的Siemens Magnetom Avanto 1.5 T超導型磁共振成像儀，體部相控陣線圈，于掃描前30分鐘肌肉注射3%戊巴比妥鈉(1～1.5 ml/kg體重)將動物麻醉，取左側臥位，用腹帶加壓腹部，腹、背側各放一沙袋固定，將肝臟置于線圈中心。常規T1WI、T2WI掃描，DWI采用單次激發平面回波成像序列，彌散敏感梯度b值取800 s/mm2，具體參數：TR=6400 ms，TE=105 ms, 矩陣192×160，層厚5.0 mm，層間距0 mm， FOV 168 mm×283 mm，激勵次數(NSA)1次。

常規T1WI、T2WI掃描圖像：觀察肝臟大小、形態、邊緣、各葉比例，肝實質信號均勻度，脾臟大小的改變，有無腹水。

DWI圖像：使用磁共振儀配套計算機軟件進行后處理，軟件自動產生ADC偽彩圖。利用ROI技術在ADC圖像上測得肝臟表觀彌散系數(ADC)。ROI為手工畫出，面積100～200 mm2，同時避免靠近肝臟邊緣、避開大血管、膽管及偽影，ROI應大于100個像素。選取3個不同層面，每個層面取3個肝臟感興趣區(肝左葉1個，肝右葉2個)，將9個測得值取算數平均值，作為肝臟ADC值；并計算相應感興趣區的指數表觀彌散系數(eADC值)。ADC值與eADC值的計算公式為：ADC=In(S低/S高)/(b高-b低)，eADC=S高/S低。S高為b高=800 s/mm2時的DWI圖像上肝臟的信號值。S低為b低=0 s/mm2時肝臟的信號值。In為自然對數。由ADC值與eADC值計算公式可推導出：eADC=e-b*ADC。

1.3 肝臟組織病理學

每次MR掃描結束后立即通過超聲引導下穿刺取得肝組織，病理取材盡量與MR中ROI設置層面相對應，并用10%福爾馬林溶液固定，48 h內石蠟包埋做成4 μm連續切片，按常規程序進行HE染色、Masson染色及VEGF免疫組織化學染色。

肝纖維化分期采用如下標準[2]：0期：無纖維化；1期：匯管區纖維化擴大，局限于竇周和小葉內纖維化；2期：匯管區周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構保留；3期：纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；4期：假小葉形成，早期肝硬化。

VEGF判定標準參照Park等[3]的方法：先用低倍鏡(40倍)觀察整個切片，選定VEGF染色最強處，然后在200倍光鏡下計數100個細胞，陽性染色細胞＜5%為陰性(-)；5%～50%為陽性(+)；＞50%為強陽性(++)。

1.4 統計學分析

統計學分析采用SPSS 13.0軟件包，P＜0.05認為有統計學意義。

所有計量資料用mean±S表示，ADC值及eADC值與肝纖維化程度的相關性，用Spearman相關分析；ADC值及eADC值在不同程度纖維化分期間差異，先采用單因素方差分析，存在顯著性差異，再用LSD法進行多重比較。

VEGF的表達以等級形式表示：陰性(-)、陽性(+)、強陽性(++)。采用秩和檢驗其在肝纖維化各期中的表達水平差異。

2 結果

2.1 肝臟大體標本改變

動物制模周期為1年，實驗終止后的大體病理顯示：肝臟質地變硬，失去光澤，邊緣圓鈍；肉眼觀：肝臟表面凹凸不平，呈小結節狀(圖1)。

2.2 MR-DWI肝臟形態影像表現與病理對照

圖2 正常犬肝臟MR成像及病理組圖。正常犬肝組織肝小葉結構完整；未見明顯膠原組織沉積；未見明顯VEGF陽性著色細胞；MRI示肝臟大小、形態正常，邊緣光滑銳利，實質信號均勻。2A：Masson染色100倍；2B：VEGF染色 100倍；2C：T2WI；2D：DWI圖像；2E：ADC圖Fig 2 The liver of normal dog MRI and pathology. In the control group, the structure of liver lobule is normal, no signi fi cant collagen deposition; no signi fi cant VEGF positive cells; The size and morphology of liver are normal, smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

隨造模時間延長，實驗組活檢標本病理顯示：纖維化程度逐漸加重，肝臟匯管區、中央靜脈周圍及肝竇壁纖維沉積增多并向外延伸，逐漸形成纖維間隔，進而肝小葉結構紊亂，部分肝小葉正常結構消失，形成假小葉，出現早期肝硬化，各期肝纖維化模型：S0 (n=10)、S1 (n=9)、S2 (n=9)、S3(n=10)、S4 (n=10)，見表1；同時血管內皮生長因子表達水平亦呈逐漸增高趨勢(表2)；但是MR-DWI肉眼觀肝臟大小、形態及各葉比例未見明顯異常，形態學不能顯示出正常肝臟與纖維化肝臟之間的差別(圖2～6)。

圖3 肝纖維化S1期犬肝臟MRI成像及病理組圖。肝纖維化S1期匯管區可見輕度增生的膠原纖維；可見散在VEGF陽性著色細胞；MRI示肝臟大小、形態未見異常，邊緣光滑銳利，實質信號均勻。3A：Masson染色100倍；3B：VEGF染色100倍；3C：T2WI；3D：DWI圖像；3E：ADC圖Fig 3 Liver fi brosis-S1 MR imaging and pathology. Fibrosis-S1 a few of collagen fibers located in portal area; A few VEGF positive cells; the size and shape are abnormal, smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

表1 實驗組制模不同時期肝纖維化程度對照表Tab 1 Comparsion liver fi brosis of the experimental group in different stage of molding

圖4 肝纖維化S2期犬肝臟MRI成像及病理組圖。肝纖維化S2期膠原纖維向小葉內延伸，但小葉結構仍保持完整；VEGF陽性著色細胞增多；MRI示肝臟大小、形態未見異常，邊緣光滑銳利，實質信號均勻。4A：Masson染色200倍；4B：VEGF染色100倍；4C：T2WI；4D：DWI圖像；4E：ADC圖Fig 4 Liver fibrosis-S2 MR imaging and pathology. Fibrosis-S2 collagen fibers extend to the lobules, but the structure of liver lobule is still intact;VEGF positive cells increased; The size and shape are abnormal, smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

圖6 肝纖維化S4期MRI成像及病理組圖。肝纖維化S4期匯管區、肝竇壁、中央靜脈周圍及肝小葉內可見明顯纖維化，部分假小葉形成，出現早期肝硬化改變；纖維帶內異型增生肝細胞及血管腔內容物VEGF強陽性表達。MRDWI肝臟大小、形態未見異常，邊緣光滑銳利，實質信號均勻。6A：Masson染色100倍；6B：VEGF染色100倍；6C：T2WI；6D：DWI圖像；6E：ADC圖Fig 6 Liver fi brosis-S4 MR imaging and pathology. Fibrosis-S4,around portal area, walls of sinusoids, central veins and the liver lobules are significant fibrotic, some pseudo-lobule formation;Strong positive expression of VEGF is much in the the fi ber band and vascular lumen. The size and shape are abnormal, smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

圖5 肝纖維化S3期犬肝臟MRI成像及病理組圖。肝纖維化S3期肝臟淤血，肝細胞腫脹，膠原纖維明顯向小葉內延伸形成纖維間隔，肝小葉結構紊亂；VEGF陽性著色細胞明顯增多呈陽性表達，以纖維帶內顯著；MR-DWI肝臟大小、形態未見異常，邊緣光滑銳利，實質信號均勻。5A：Masson染色100倍；5B：VEGF染色200倍；5C：T2WI；5D：DWI圖像；5E：ADC圖Fig 5 Liver fi brosis-S3 MR imaging and pathology. Fibrosis-S3, liver congestion, liver cell swelling, collagen fibers is significantly extented to the lobular, fibrous septa is formed; Lobules of liver is disorder; VEGF positive cells are significantly increased, especially in the fiber band; the size and shape are abnormal,smooth edges, the signal of liver parenchyma is homogenous in MRI.

表2 犬肝纖維化各期VEGF表達水平對照表Tab 2 Comparsion liver fi brosis stages of VEGF expression

2.3 DWI ADC值與EADC值與肝纖維化程度的關系

隨肝纖維化程度加重，ADC值逐漸減低，eADC值依次增高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3，ADC值與肝纖維化程度顯著負相關(P＜0.01)；EADC值與肝纖維化程度顯著正相關(P＜0.01)，見表4。

2.4 ADC值與EADC值在肝纖維化診斷中的價值

將ADC值的1100或eADC值的0.42視為診斷肝纖維化的閾值，則ADC值區分正常肝臟與肝纖維化的特異性為90%，敏感性為97.4%；EADC區分正常肝臟與纖維化的特異性為81.8%，敏感性為99.3%，見表5。

表3 不同程度纖維化分期組間ADC值、eADC值結果Tab 3 The results of ADC values and eADC values in varying degrees of fi brosis

表4 ADC值、eADC值與纖維化程度的相關性Tab 4 The correlation between ADC values (eADC values)and fi brosis

表5 ADC值與EADC值在肝纖維化診斷中的價值Tab 5 Diagnostic value of ADC values and eADC values in hepatic fi brosis

3 討論

3.1 肝纖維化動物模型的制備

目前文獻中所選用的實驗動物多以小動物如鼠、兔等為主，但鼠、兔肝臟體積小，耐受力差，死亡率高；且成模時間短，多在12～18周左右，不符合人類慢性肝病的致病過程。本研究選用犬作為肝纖維化動物模型，相對嚙齒類小動物，其飼養簡單，生命力強，肝臟體積大，有利于影像學觀察及肝穿病理檢測，從而可以對肝纖維化進程進行動態觀察與評估。另外本實驗采用腹腔注射小劑量、低濃度的CCl4植物油溶液，配合高脂低蛋白飲食的制模方法，雖制模周期長，但肝纖維化進展穩定，模擬了從肝細胞變性-肝纖維化-早期肝硬化的全過程，更接近人類慢性肝病的發生，同時降低實驗動物死亡率，且成活時間長，便于動態觀察肝纖維化進展，并獲得纖維化各期模型，有利于進一步研究肝纖維化病理與影像學的相關改變。

3.2 DWI對肝纖維化的診斷價值

DWI是基于組織內水分子的彌散運動。機體內水分子的運動會受到細胞膜及組織間質中大分子的限制；而不同的組織結構和分子環境對水分子熱運動的限制程度不同，DWI通過檢測機體組織內水分子的運動狀態來反映組織的結構功能特點[4-5]。研究表明ADC值可以量化反映組織的病理變化[6-7]。但是肝纖維化及肝硬化對ADC值的影響還未取得一致的意見。大多數學者[8]研究認為肝纖維化時由于細胞外間隙內大量纖維組織彌漫性增生、沉積，限制了水分子的擴散運動導致ADC值減小。而楊正漢等[9]認為ADC值降低的主要原因可能是因為纖維組織的增生影響了肝臟微循環，導致肝實質內血流灌注減少所致。不少國內外學者[10-14]研究發現，肝纖維化時ADC值也較正常減低，肝纖維化程度增加與肝實質ADC值的下降之間呈顯著負相關。

在本實驗中，通過大動物的慢性肝纖維化的動態研究顯示，雖肝纖維化程度加重，但常規MR平掃未見肝臟大小、形態及信號異常，從形態學上不能顯示出正常肝臟與纖維化肝臟之間的差別。但通過DWI成像，隨著肝纖維化程度的加重，ADC值逐漸降低，EADC值逐漸升高；且不同程度纖維化組間ADC值、EADC值差異亦有統計學意義。ADC值的大小與纖維化程度呈顯著負相關，EADC值的大小與纖維化程度呈顯著正相關。DWI參數可以對不同程度肝纖維化做定量分析，且其敏感性及特異性較高，統計結果顯示：將ADC值的1100或EADC值的0.42 為診斷肝纖維化的閾值，有一定價值。因此，ADC值及EADC值是不同程度纖維化較有意義的評價指標。

結合現有文獻分析，肝纖維化時ADC值下降可能與下列因素有關：①由于細胞外間隙內大量纖維組織彌漫性增生、沉積，限制了水分子的擴散運動；②增生紊亂的纖維組織影響了肝臟微循環，導致肝內血流灌注減少；③肝纖維化過程中同時伴有肝細胞水腫變性、炎細胞增多亦限制水分子運動。

3.3 肝纖維化過程中VEGF的改變

VEGF與各種肝病的關系逐漸受到重視，其在各種肝病中的作用已被廣泛研究，并證實VEGF在肝竇內皮細胞的生長，對肝細胞再生以及良、惡性肝病的發生發展均起重要作用。研究表明，肝細胞表達的血管生長因子是肝纖維化進展的關鍵因素[15]。嚴家春等[16]研究認為VEGF在肝內血管增生、改建中起到關鍵作用,而肝內微循環血管破壞、炎癥、阻塞及增生病變和肝竇毛細血管化，則是引起肝壞死、肝纖維化的最主要原因之一。本實驗結果發現隨肝纖維化程度加重血管內皮生長因子表達水平明顯增高。肝纖維化時肝內血流灌注減少，氧分壓降低，缺氧導致VEGF的表達上調，VEGF誘導肝細胞、肝竇內皮細胞、血管內皮細胞有絲分裂，有利于肝纖維化。

本實驗結果表明，DWI比傳統形態影像能更早地反映肝纖維化病變。隨肝纖維化程度加重，肝臟ADC值下降，eADC值升高，ADC值及eADC值與肝纖維化程度具有良好的相關性，提示DWI具有定量分析肝纖維化嚴重程度的能力。隨肝纖維化進展，VEGF表達水平增高，因此調整VEGF的表達強度，改善肝組織血液淤積缺氧，是抗肝纖維化治療中亟待研究解決的重要課題。

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